Сочинение на тему Введение мечения гистидина и зеленого флуоресцентного белка (GFP) в молекулярной биологии

Достижения в области молекулярной биологии не могли быть достигнуты без введения мечения гистидином и зеленым флуоресцентным белком (GFP). Эти методы помогают в очистке белка и понимании молекулярных и клеточных процессов посредством отслеживания флуоресценции белка соответственно. Использование этих методов чрезвычайно распространено в современной области молекулярной биологии.

Мечение гистидином – это метод очистки, при котором остатки гистидина добавляются к карбоксильному или аминоконцу целевого белка. При конструировании рекомбинантного белка гистидиновые кодоны должны быть добавлены в кадре к белку, представляющему интерес, для правильной трансляции метки. Шесть гистидиновых остатков обычно используются в качестве метки, но где-то от двух до десяти остатков были использованы. Рекомбинантные белки с такими метками могут быть очищены с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом на основе взаимодействия между имидазольным кольцом гистидина и ионом переходного металла, прикрепленным к колонке. Гистидин имеет электронодонорные группы в своем имидазольном кольце, которые будут селективно связываться и образовывать координационные связи с переходными металлами Co2 +, Ni2 +, Cu2 + или Zn2 +. Наиболее часто используемый ион металла – это Ni2 +; однако было показано, что Co2 + обеспечивает наивысшую чистоту белка. Белки без гистидиновой метки не будут связываться с колонкой и будут вымываться. Меченые белки сохраняются в матрицах колонок до его высвобождения путем добавления увеличивающихся концентраций свободного имидазола, который действует как молекула-конкурент, или путем снижения рН колонки для протонирования ионов металлов, разрушающих координационные связи. Мечение гистидином обеспечивает чрезвычайно быстрый и эффективный метод выделения интересующего белка.

GFP был впервые выделен из медузы Aequorea Victoria и теперь используется для мониторинга экспрессии генов и локализации белка в живых организмах. Структурно GFP образует хромофор с его серин-дегидротирозин-глициновым мотивом, обнаруженным в гексапептиде, начинающемся с аминокислоты 64, и эта последовательность будет оптимально поглощать ультрафиолетовый свет 395 нм или синий свет 475 нм и излучать ярко-зеленый свет 509 нм. Когда GFP был клонирован и экспрессирован в Escherichia coli, наблюдаемая флуоресценция означает, что ген и полученный белок содержали всю необходимую информацию для синтеза хромофора, и никаких дополнительных ферментов или кофакторов не требуется. GFP слит в рамке с геном, кодирующим эндогенный белок на С-конце или N-конце. Кроме того, можно добавить линкерную последовательность, чтобы обеспечить правильное свертывание и функцию GFP и представляющего интерес белка. Белок, помеченный GFP, может быть визуализирован и отслежен в живых клетках при воздействии длинноволнового УФ-света.