Создание 3D-модели рака поджелудочной железы для характеристики радиационной реакции опухолевых клеток сочинение пример

ООО "Сочинения-Про"

Ежедневно 8:00–20:00

Санкт-Петербург

Ленинский проспект, 140Ж

Сочинение на тему Создание 3D-модели рака поджелудочной железы для характеристики радиационной реакции опухолевых клеток

1. Состояние искусства:

Сфероиды были признаны подходящим инструментом для имитации микроокружения in vivo многих солидных опухолей. В отличие от однослойных клеточных культур, они отражают более физиологическую ситуацию в модулированных тканях [3]. Несмотря на свою простоту, однослойные клеточные эксперименты не всегда можно перенести на исследования на животных [5]. В общем, предполагается, что 2D и 3D по-разному реагируют на облучение и химиотерапевтические агенты [9].

Трехмерная организация позволяет клеткам расти концентрически, что приводит к образованию наружного пролиферативного слоя (P-слоя), внутреннего покоящегося слоя (Q-слоя) и центрального некроза, который действительно напоминает настоящую опухоль, сидящую in vivo. [3]. Эта клеточная организация приводит к гетерогенному распределению кислорода, питания, факторов роста и клеточных рецепторов, соответственно, клеточной сигнализации [3]. Кроме того, эти параметры влияют на клеточный ответ на облучение. Кислород был чрезвычайно исследован в течение последних десятилетий и считается, что он связан с 65% радиационного повреждения ДНК.

Таким образом, гипоксия составляет значительную долю радиационной стойкости [12]. Различия в пролиферации и метаболической активности в разных регионах (P, Q, N) также связаны с различием в радиационном ответе между клетками [13]. Сотовая передача сигналов также связана с различиями в репаративном ответе [12]. В совокупности это, в свою очередь, демонстрирует выполнимость этой модели для напоминания микросреды рака поджелудочной железы, где десмопластическая строма, секретируемая главным образом звездчатыми клетками поджелудочной железы (PSC), и отложение компонентов внеклеточного матрикса (ECM) [14] приводят к гетерогенному распределению и нарушению доставки О2 и питание. Этот уникальный фенотип был связан с устойчивостью к химиотерапии и облучению (7). Таким образом, 3D-модели дают особые обещания в отношении точной и гибкой модели для повторного выявления рака поджелудочной железы.

Хорошо зарекомендовавшие себя в настоящее время методы получения трехмерных сфероидов – это метод наложения жидкости (LO), подвесная капля (HD) и перемешивание вращающимися колбами (15). Действительно, методы HD и LO позволили создать сфероиды одинакового размера [15]. Однако в контексте излучения, где стохастический эффект делает отклик каждой ячейки уникальным, существует необходимость в применении радиационного эксперимента на сотнях повторностей для получения статистически достоверных данных. Последнее является преимущественным свойством метода, представленного (Thomasen et. 2017) под названием CAMA (анализ конической агарозы с микроячейками), который позволяет получать сотни повторностей с использованием микроячейок, каждая способствует росту только одного агрегата (11), что позволяет этому методу соответствовать больше в контексте нашего проекта.

Использование 3D-моделей рака поджелудочной железы начинает развиваться в направлении моделирования выборки пациентов в 3D-модели, позволяющие использовать персонализированные подходы к терапии [16-18]. Однако рак поджелудочной железы обычно диагностируется на поздней стадии [19], соответственно, с недифференцированной опухолевой тканью высокой степени тяжести. Следовательно, меньше возможностей для формирования трехмерных структур, так как им не хватает адгезии и межклеточного контакта (10). Исходя из этого, также высококлассные линии клеток поджелудочной железы не могли образовывать сфероиды (Miapaca-2) или образовывать нерегулярные сфероиды (Paca-1), как показано в результатах Sipes et al. (10). То же самое применимо к 26 клеточным линиям из 60 различных раковых клеточных линий, отобранных из NCI для генерации сфероидов [20]. Thomasen et al. (11) сообщили о преодолении этого ограничения с помощью CAMA путем формирования клеток в конические агрегаты, что позволяет определять объем независимо от способности клеток образовывать сфероиды. Это демонстрирует осуществимость этого метода, поскольку объем опухоли является центральным параметром для оценки реакции опухоли на терапию с использованием лучевой терапии [21].

Насколько нам известно, радиобиологическое исследование не изучало влияние радиации с использованием иммуногистохимии на модель многоклеточного рака поджелудочной железы. Как правило, только несколько исследований сочетали иммуногистохимию с измерением объема для оценки радиобиологического ответа на различные виды рака. Например, Afkar et.al [22] смогли получить сравнительный и описательный анализ IHC с использованием двух разных опухолей в качестве модели (Neuroendocrine BON1 и аденокарцинома толстой кишки HCT116) с использованием IHC для фазы G2, апоптоза и старения. Накаджима и др. [23] сообщили также о возможности радиобиологического анализа IHC 6 сфероидов, полученных у пациентов с раком шейки матки, с использованием маркеров для гипоксии и апоптоза.

Целью нашего проекта является оценка возможности анализа радиобиологического ответа клеточных линий рака поджелудочной железы с известной различной чувствительностью (Panc1-Mia paca 2-T3M4) с использованием модели CAMA в сочетании с маркерами IHC для гипоксии, апоптоза и восстановления.

2. Цели:

2.1 Характеристика исследованных клеточных линий рака поджелудочной железы:

Первоначальная характеристика будет включать изучение характеристик роста и пролиферации с использованием анализа Alamar blue. Будет также проведен колониеобразующий анализ для оценки разницы в радиационной чувствительности исследуемых клеточных линий на однослойной культуре.

2.2 Установление протокола приготовления сфероидов (клеточных агрегатов):

Используя конический анализ с использованием микроячеек с агарозой, трехмерные клеточные агрегаты будут посеяны из трех исследованных клеточных линий. Будет исследовано оптимальное количество клеток, которое должно быть посеяно из разных клеточных линий.

2.3 Оценка способности модели указывать различные значения чувствительности к излучению, используя объем клеточных агрегатов в качестве показаний:

Будут исследованы возможности модели оценивать дозозависимые эффекты лучевой терапии с использованием объема клеточных агрегатов в качестве конечной точки. Объемы будут рассчитываться по площади клеточных агрегатов, обнаруженных под микроскопом.

2.4 Описательный анализ гетерогенных радиобиологических реакций с использованием иммуногистохимии.

Мы исследуем добавленную стоимость окрашивания IHC, чтобы получить представление о молекулярном радиобиологическом ответе, выбирая репарацию, гипоксию и апоптоз в качестве возможных процессов.

3. Рабочая программа:

3.1 Линии клеток и условия культивирования:

Клеточные линии аденокарциномы поджелудочной железы (PDA) Panc1, Mia-paca 2 и T3M4 будут размножены в виде однослойной культуры. Первые 2 клеточные линии будут культивированы в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% FBS фетальной бычьей сыворотки (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), 1% комбинированных антибиотиков: 100 МЕ пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. T3M4 будет культивироваться в среде RPMI 1640 (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) с добавлением, как указано выше. Клетки инкубируют при 37 ° С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2.

3.2 Анализ распространения:

Для оценки роста клеточных линий в 96-луночный планшет будут посеяны клетки с разными номерами 1000, 2000, 3000, со средой в качестве отрицательного контроля, а затем с инкубацией при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2.10 мкл. Alamar Blue будет добавляться через разные промежутки времени (24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов) и инкубироваться в течение 4 часов. Поглощение будет измеряться при 570 нм и 630 нм. Среднее значение абсорбции будет рассчитано после вычитания пустого значения и значения 630 нм. Конечные сравнительные данные будут получены из 3 биологических повторностей.

3.3 Испытания на радиационную чувствительность:

Выживаемость клеток после облучения будет измеряться с помощью анализа колониеобразования. Клетки будут помещены в 6-луночные планшеты и облучены различными дозами облучения в диапазоне от 0 до 8 Гр. Клетки инкубируют при 37 ° С в течение 10-14 дней с последующей фиксацией формалином и окрашиванием с использованием 0,1% кристаллического фиолетового. Колонии ≥50 клеток будут подсчитаны под световым микроскопом, и будет определена выживающая фракция для каждой клеточной линии при каждой дозе как минимум для 3 биологических повторов.

3.4 Культура агрегатов опухолевых клеток:

Агарозная микролунковая матрица (формат 3D Co Seedis Starter kit-2 * 2) будет помещена в 6-луночные планшеты с 4 мл среды. Клеточные суспензии будут подготовлены для добавления 1000 клеток для каждой полости в соответствии с инструкциями производителя. Средний будет меняться через равные промежутки времени.

3.5 Облучение клеточных агрегатов для считывания объема и монослойной культуры для анализа колониеобразования:

Облучение будет проводиться с использованием клеточного облучения на рентгеновском снимке RS225, Gulmay Medica, Klinikum rechts der Isar, Мюнхен, Германия.

3.6 Считывание томов и анализ изображений

Пластины будут сканироваться с течением времени после облучения через равные промежутки времени с использованием инвертированного микроскопа. Изображения будут сниматься каждые 4 дня. Проецируемая площадь каждой агрегированной ячейки будет измерена с использованием программного обеспечения Image J версии 1.50i (Уэйн Расбанд, NIH, Бетесда, Мэриленд, США), затем объем конической ячейки рассчитывается по формуле производителя.

3.7 Иммуногистохимия (IHC)

Клеточные агрегаты, контактирующие с микролунками, будут покрыты 2% -ным раствором формалина в PBS в течение ночи и герметизированы с помощью теплой агарозы с низкой температурой плавления 2,4%. После погружения парафина агрегированные клетки, содержащие CAMA, будут разрезаны вручную и установлены на предметные стекла, депарафинизированы (с использованием ксилола) и гидратированы с использованием этанола. Предметные стекла будут окрашены с использованием (H & E) и окрашены для иммуногистохимии с использованием γ-H2ax, каспазы 3; HIF-1-альфа. Перед установкой покровного стекла (H & E) будет произведено противоокрашивание.

3.8 Статистический анализ

Статистический анализ средств измерений будет выполняться с использованием Graph Pad Prism 6.0 (Graph Pad Software, Inc., CA и USA).

Поделиться сочинением
Ещё сочинения
Нет времени делать работу? Закажите!

Отправляя форму, вы соглашаетесь с политикой конфиденциальности и обработкой ваших персональных данных.