Ключевыми характеристиками, которые делают Lactococcus lactis и Bacillus subtilis идеальными микроорганизмами для пищевой промышленности, являются общепризнанные как безопасные (GRAS), они имеют аннотированные геномы, их можно легко культивировать и доступны различные инструменты для их генетической манипуляции. В последние годы эти две бактерии доказали свою высокую способность к секреции гетерологичных и гомологичных белков. Штаммы со способностью секретировать большие количества белков представляют большой интерес для промышленности по разным причинам.
В этом исследовании исследуется возможность улучшения секреции белка у Lactococcus lactis и Bacillus subtilis с помощью адаптивной эволюции и случайного мутагенеза. Первым шагом для улучшения способности к секреции у Lactococcus lactis было создание рекомбинантных штаммов со способностью секретировать гетерологичные ферменты β-галактозидазу и β-глюкозидазу. Фермент β-галактозидаза является продуктом гена LacZ, который входит в состав оперона Lac в Escherichia coli. В своей естественной форме фермент находится в цитоплазме, поэтому для того, чтобы Lactococcus lactis мог секретировать фермент, последовательность, кодирующую сигнальный пептид, должна быть добавлена перед последовательностью фермента. Выбранная сигнальная лидерная последовательность была из Usp45, основного Sec-зависимого белка в Lactococcus lactis. Обе последовательности будут клонированы ниже промотора gapB, который естественным образом контролирует экспрессию фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, очень важного фермента, участвующего в гликолизе. Фермент β-глюкозидаза происходит из Saccharophagus degradans, и он будет клонирован в экспрессирующем векторе, который дает сигнальный пептид. После успешного получения рекомбинантных штаммов L.lactis способность к секреции будет проверяться с использованием скрининга микрофлюидики на основе капель. Сортировка капель, в которых β-галактозидаза была обнаружена внеклеточно, была основана на передаче энергии флуоресцентного резонанса (FRET). Разработка протокола для обнаружения β-галактозидазы в каплях с использованием FRET также была одной из целей этого проекта. Клетки со способностью секретировать фермент β-глюкозидазу выбирают на основе флуоресценции, получаемой в результате катаболизации флуорогенного субстрата. Клетки, которые были бы выбраны из общей популяции, подвергались бы множеству раундов адаптивной лабораторной эволюции и скринингу на основе микрофлюидики на основе капель для дальнейшего повышения эффективности секреции.
Bacillus subtilis естественным образом секретирует фермент α-амилазу, таким образом, нет необходимости вставлять какой-либо гетерологичный белок в бактерию. Микроорганизм подвергали обработке 3 различными концентрациями агента мутагенеза этилметансульфата для индукции мутаций, которые могут оказаться полезными. Кроме того, способность к секреции была проверена путем использования силы эволюции. Микроорганизм переносили ежедневно в течение 7 недель в новых средах с конечной целью создания штаммов с накопленными полезными мутациями и улучшенными характеристиками роста. Штаммы, полученные с помощью обоих подходов, были исследованы с использованием турбидиметрического мониторинга роста бактерий. Скорости роста были дополнены показателями разложения крахмала, а также для проверки того, как рост соотносится с разложением крахмала. В обоих случаях не было отмечено никаких улучшений ни в темпах роста, ни в показателях деградации крахмала. Этот тезис является частичным выполнением требований для получения степени магистра наук. степень в области биотехнологии, в Техническом университете Дании (DTU). Диссертация охватывает 30 баллов ECTS и является продуктом разработки в сотрудничестве с Национальным институтом питания при DTU.
Я хотел бы выразить свою благодарность старшим научным сотрудникам Клаусу Хейнеру Банг-Бертельсену и Постдоку Виноту Виньесварану за то, что они приняли меня в свою исследовательскую группу и сделали это исследование возможным. Они всегда были доступны, чтобы помочь мне и вести меня на протяжении всего проекта. Кроме великих надзирателей, они тоже великие наставники. Их поддержка, доверие и понимание в трудные времена были действительно важны для завершения проекта. Я также хотел бы поблагодарить Майка Вестергаарда, который очень помог мне в постановке экспериментов во время проекта. Большое спасибо лаборанту Тине Сур и всем членам исследовательской группы за доброту и готовность помочь. Наконец, я выражаю огромную благодарность отцу, маме и сестре за их поддержку. Гетерологичная и гомологичная секреция белка представляет собой область, представляющую большой интерес для пищевой промышленности. Чуть менее половины всех ферментов, продаваемых в мировом масштабе, соответствуют пищевым и кормовым ферментам (Fernandes, 2010). Независимо от того, насколько мощный фермент, его использование в промышленности напрямую связано с наличием организма-хозяина, из которого белок может быть успешно выделен и в больших количествах. Таким образом, поиск микроорганизмов со способностью секретировать значительные количества белков является областью интенсивных исследований.
Двумя сильнодействующими бактериями, которые изучаются на предмет их способности секретировать гомологичные и гетерологичные белки, являются Bacillus subtilis и Lactococcus lactis (García-Fruitós, 2012). Секреция белка является многофакторным процессом, который требует дальнейшего детального выяснения, чтобы использовать фол потенциал этих микроорганизмов. Переменными, которые составляют уравнение секреции белка, являются тип промотора, эффективность трансляции мРНК, количество и тип внутриклеточных и внеклеточных протеаз, тип сигнального пептида, наличие пропептида, тип секреции система, правильное сворачивание белка, различные шапероны и возможность стрессовой реакции из-за избыточной экспрессии белка [(Nijland & Kuipers, 2008), (Morello et al., 2007)].
Мужчины очень долго правили в индустрии фитнеса. Не удивительно, что женщины в равной конкуренции соревнуются с мужчинами в индустрии фитнеса. Они также ищут идеальное тело,
Если взглянуть на школы в Ричмонде, штат Калифорния, и сравнить их со школами в Конкорде, штат Калифорния, можно увидеть огромную разницу. Мало того, что жилой
Преподавание существительных в важной области интересов в преподавании английского языка, которая всегда привлекала мое внимание и внимание моих учеников. Это обширная область, которая может связать