Основные моменты:
- Интеллектуальный хемодозиметр для гидразина, хорошо растворимый в воде, селективный, чувствительный, как колориметрический, так и ратиометрический флуоресцентный зонд.
- Этот зонд может количественно определять гидразин в течение 1 мин.
- Этот зонд показал хорошую проницаемость для клеток, низкую цитотоксичность, быстрое флюорогенное распознавание и обнаружение гидразина невооруженным глазом ниже уровней TLV, присутствующих в живых клетках, питьевой воде и промышленных стоках.
- Этот зонд также полезен для обнаружения гидразина в пруду и питьевой воде.
- Это обнаруживает гидразин как в растворе, так и в твердой фазе с высокой эффективностью.
- 1H ЯМР и масс-спектрометрия были использованы для анализа механизма ответа.
Воздействие гидразина приводит к повреждению всех жизненно важных органов человека и животного, что требует открытия быстрого и количественного метода обнаружения. Недавно разработанный и синтезированный зонд показал хорошую проницаемость для клеток, низкую цитотоксичность, быстрое флюорогенное распознавание и обнаружение гидразина невооруженным глазом ниже уровней TLV, присутствующих в живых клетках, питьевой воде и промышленных стоках.
Ключевые слова: хемодозиметр, колориметрия, быстрый флуоресцентный датчик, гидразин, биоизображение.
Введение
Гидразин (H2N-NH2) является химически сильным основанием, нуклеофилом и восстановителем, и его высокая реакционная способность приводит к широкому спектру применения, особенно в отраслях промышленности для крупномасштабного производства высокоэффективных аэрокосмических пропеллентов, фармацевтических препаратов, агрохимикатов, полимеров, красителей и химические вещества [1]. Легковоспламеняющийся и детонирующий гидразин используется в качестве ингредиента для ракетного топлива и воздушной подушки [2], синтеза азобисформамида (AC) [3], диизопропилкарбоната и толуолсульфонгидразида (TSH) [4], ингибитора коррозии для атомных и электрических электростанций [ 5], вспенивающиеся полимеры и альтернативный источник энергии для инновационных топливных элементов нового поколения. Несмотря на широкое применение, гидразин, его паровые и водные растворы являются взрывоопасными и ядовитыми по своей природе, которые могут всасываться людям и животным при воздействии на кожу, при оральном применении и вдыхании [6]. Высокотоксичный гидразин уменьшает среднюю продолжительность жизни промышленных рабочих и повреждает их печень, почки, легкие, центральную нервную и дыхательную системы [7]. Пороговое предельное значение (TLV) гидразина в питьевой воде должно поддерживаться на уровне 10 частей на миллиард [8]. Поэтому мгновенное обнаружение чрезвычайно опасного гидразина представляет значительный интерес, и это особенно важно для контроля уровней его концентрации в промышленной зоне, количественного определения в крови человека и питьевой воде.
Качественное и количественное обнаружение гидразина с помощью обычной титриметрии [9], спектрохимии [10], электрохимии [11], хемилюминесценции [12], хроматографии [13] и спектроскопии комбинационного рассеяния поверхности [14] нежизнеспособны для анализы in vivo. В этом отношении современные флуоресцентные методы – это простой, недорогой, быстрый мониторинг в режиме реального времени, который является идеальным методом для обнаружения гидразина in vivo [15]. Таким образом, обнаружение флуоресценции гидразина на основе снятия защиты стало важным инструментом, использующим ацетил [16-21] 4-бромбутират [22-23] левулинат [24-25], фталимиды [26-29], альдегиды [30-31 ], малононитрилы [32-34], бензойные кислоты [35-36], γ-оксо-1-пиренбутираты [37], трифторацетилацетонаты [38] и ацетилацетонаты [29-40]. Тем не менее, большинство из этих флуоресцентных зондов страдает от более длительного времени обнаружения. Недавно Chow et al. [41] сообщили, что этилцианоацетат-защищенный зонд для гидразина имеет предел обнаружения 12 мкм и обнаружение в течение 8 минут. Этот зонд показывает очень плохую растворимость в воде, так как титрование проводилось в буфере: ДМСО (1: 9). Из-за недостаточной растворимости в воде эти зонды могут не подходить для биологического применения. Li et al. [42] также сообщили о подобном защищенном зонде для гидразина с пределом обнаружения 1,6 мкМ и обнаружением в течение 15 мин. В случае этого зонда поглощение и флуоресцентное титрование проводили в воде / ДМСО (4: 6). Наша цель – разработать и синтезировать практически полностью водорастворимый зонд в качестве эффективного индикатора «невооруженным глазом» и хемодозиметра для быстрого распознавания гидразина, присутствующего в крови человека и питьевой воде, с довольно низким пределом обнаружения.
Бензотиазольный фрагмент был установлен в нашем разработанном зонде этил 3- (3- (бензо [d] тиазол-2-ил) -5-бром-2-гидроксифенил) -2 цианоакрилата (3, BBHC, схема 1) для достичь процесса внутримолекулярного переноса фотонов (ESIPT) в возбужденном состоянии при фотовозбуждении [44-45]. ESIPT приводит к тому, что атом «О» в фенольном ОН сильно электроотрицателен, что, в свою очередь, вызывает более положительный характер в атоме углерода -CN. В присутствии -Br и -CN электрофильная природа двойной связи C = C резко возрастает по отношению к нуклеофильному гидразину для быстрого образования окрашенного гидразона, 2- (бензо [d] тиазол-2-ил) -4-бром- 6- (гидразонометил) фенол (4, ВВНР).
В результате этого распознавания можно наблюдать даже невооруженным глазом и изменением флуоресценции, что поможет колориметрически и флуорогенически определить гидразин при количественном измерении.
Разработанный зонд (BBHC) был синтезирован путем окислительной циклизации о-аминотиофенола с 5-бромсалициловым альдегидом (стадия 1, схема 2) до 2-арилбензотиазола (1), формилирование от 1 до 2 (стадия 2) и катализирование пиперидина конденсация (стадия 3) 2 с этилцианоацетатом до 3. Новый зонд был получен с высокими выходами, и его структура была установлена с помощью 1 Н ЯМР, 13 С ЯМР и ESI MS спектроскопического анализа (ESI).
Схема 2: Синтетические пути к BB HC-рецептору (3)
Экспериментальный раздел
Общие методы.
Все материалы были приобретены у Sigma-Aldrich Chemicals Private Limited и использовались без дальнейшей очистки. Все растворители были закуплены у отечественных поставщиков и использовались после перегонки. Спектры 1Н-ЯМР и 13С-ЯМР регистрировали на приборах Brucker 300 МГц. CDCl3 использовали в качестве растворителя с TMS в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги выражаются в единицах δ, а константы связи в Гц. Точки плавления определяли на приборе для определения температуры плавления с горячей пластиной в капилляре с открытым ртом и не корректировали. Эксперименты по УФ-визуализации проводились на спектрофотометре Perkin Elmer Lambda 750, а эксперименты с флуоресценцией – с использованием Perkin Elmer LS 55 с флуоресцентной ячейкой с длиной пути 10 мм. Колоночную хроматографию осуществляли с использованием силикагеля 60 (60-120 меш). Для определения времени жизни флуоресценции использовали установку, основанную на коррелированном по времени подсчете одиночных фотонов (TCSPC).
Общий метод УФ-визуализации и флуоресцентного титрования с помощью УФ-визуализации и флуоресценции.
Готовили исходный раствор зонда (c = 2 × 10-5 ML-1) в CH3CN: H2O (1: 9, об. / об.). Раствор гостевых анионов, ионов металлов и аминсодержащих соединений готовили (2 × 10-4 ML-1) в CH3CN: H2O (1: 9, об. / Об.) При pH 7,1 с использованием 10 мМ буфера HEPES. Раствор датчика готовили с помощью соответствующей методики разбавления. Спектры этих растворов регистрировались методами УФ-визуализации и флуоресценции.
Подробности визуализации живых клеток
Для оценки эффективности BBHC по эндогенному обнаружению гидразина у здорового добровольного донора (мужчина, 32 года) с его информированного согласия было получено 5 мл венозной крови. Мононуклеарные клетки периферической крови или РВМС (лимфоциты и моноциты) выделяли в течение одного часа после отбора образцов центрифугированием в градиенте плотности с использованием histopaque-1077 (Sigma) путем центрифугирования при 400 × g в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Средний слой или «слоистый слой» содержит РВМС, которые были тщательно собраны и дважды промыты в фосфатно-буферном растворе (PBS, pH 7,4). РВМС были повторно приостановлены в PBS и разделены на шесть комплектов. Клетки инкубировали в течение 1 ч 37 ° С в темноте с 10, 20, 30, 40 и 50 мкМ N2H4 соответственно вместе с 5 мкМ ВВНС. Отдельный набор PBMC инкубировали одновременно с 5 мкМ BBHC, но без N2H4. Интенсивность внутриклеточной флуоресценции определяли с помощью флуоресцентного микроскопа (Carl Zeiss HBO 100) при 40-кратном увеличении в наборе фильтров 49 DAPI, который дает пик излучения для 464 нм.
Для определения жизнеспособности клеток против BBHC PBMC обрабатывали различными концентрациями раствора BBHC (2-20 мкМ) в течение 1 часа при 37 oC против контрольной суспензии клеток без добавления BBHC. Плотность клеток остается 96 клеток на лунку в 96-луночном планшете. 100 мкл раствора МТТ (5 мг / мл) добавляли в каждую лунку, включая контроль, и инкубировали в течение 4 часов. при 37 ° С Кристаллы цинка в пурпурной форме растворяли в 100 мкл ДМСО и измеряли поглощение при 570 нм. Жизнеспособность клеток рассчитывали с использованием следующего расчета.
Способ приготовления пластинчатых палочек для ТСХ.
Его легко получить, погрузив пластину ТСХ в раствор BBHC (2 × 10-4 М) в CH3CN (1 мМ) и подвергнув его воздействию воздуха для испарения растворителя. Обнаружение гидразина осуществляли, вставляя пластину ТСХ с различной концентрацией гидразина (1 мМ) и выпаривая растворитель досуха.
Синтез:
2.5.1 Синтез 2- (бензо [d] тиазол-2-ил) -4-бромфенола (BBP) (1):
Раствор 2-аминотиофенола (2 мл, 2 ммоль) и 5-бромсалицилдегида (400 мг, 2 ммоль) в EtOH (5 мл), водной H2O2 (30%, 12,0 ммоль) и водной HCl (37%, 8,5) ммоль) перемешивали при температуре окружающей среды в течение 6 часов. Раствор гасили 10 мл воды. Осадок отфильтровывают, промывают этанолом, сушат в вакууме и перекристаллизовывают из EtOH, получая желаемый продукт в виде белого твердого вещества (480 мг, выход 79,47%).
Синтез 3- (бензо [d] тиаол-2-ил) -5-бром-2-гидроксибензальдегида (BBHB) (2):
Соединение 1 (420 мг, 1,2 ммоль), гексаметилентетрамин (420 мг, 3 ммоль) и трифторуксусную кислоту (5 мл) добавляли в круглодонную колбу. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение ночи. После охлаждения смеси кислоту нейтрализовали водным раствором КОН. Осадок собирали фильтрацией и несколько раз промывали водой. После сушки в вакууме соединение 2 было получено с выходом> 99% и имело следующие спектральные свойства.
Синтез рецептора (BBHC):
Соединение 2 (100 мг, 0,3 ммоль), этилцианоацетат (68 мкл, 0,6 ммоль) и 2-3 капли пиперидина растворяли в 10 мл этанола. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 3 ч при 80 ° С и охлаждают до комнатной температуры. Конечный продукт (зонд BBHC, 110 мг, 82%) получали фильтрацией и трижды промывали этанолом.
Синтез 2- (бензо [d] тиазол-2-ил) -4-бром-6- (гидразонометил) фенола (BBHP):
BBHC смешивали с одним эквивалентом гидразина в ацетонитриле при комнатной температуре с получением желтого раствора. После удаления растворителя получали твердый продукт, который использовали для 1 H-ЯМР и масс-спектроскопии.
Мужчины очень долго правили в индустрии фитнеса. Не удивительно, что женщины в равной конкуренции соревнуются с мужчинами в индустрии фитнеса. Они также ищут идеальное тело,
Полимеры представляют собой большие молекулы и имеют одну и ту же структурную единицу, повторяющуюся снова и снова, и эти повторяющиеся единицы известны как мономеры. Эти
Анализ мыльных опер. Краткая история Жанр мыльной оперы появился на американском радио в 1930-х годах и получил свое название благодаря спонсорской поддержке программ крупными компаниями,