Сочинение на тему Идентификация и локализация белков S-слоя двух Acidithiobacillus

Acidithiobacillus штаммы SP5 / 1 и HV2 / 2 являются палочковидными, грамотрицательными, γ-протеобактериями, аэробно-пирит-окисляющими и ацидофильными бактериями, которые оптимально развиваются при 30 ° C и 45 ° C соответственно (Klingl, Moissl-Eichinger) и др. 2011). Сходство молекулярной структуры S-слоя по симметрии у близкородственных видов можно использовать в качестве таксономической характеристики, которая определяет филогенетическое положение организма (Baumeister and Lembcke 1992, Klingl, Moissl-Eichinger et al. 2011). Белок S-слоев обволакивает поверхность бактерий и может собираться сам.

Белок содержит 2-D псевдокристаллический с изменением (p1, p2, p3, p4 или p6) симметрии (Eichler 2003). Два упомянутых штамма обладают белком S-слоя с p2-симметрией (Klingl 2007). Поверхностный слой сначала идентифицируют в клеточной стенке Spirillum sp. (Houwink and Le Poole 1952, Houwink 1953), и с сегодняшнего дня он обнаружен почти во всех таксономических бактериальных и архейных оболочках (Rachel, Pum et al. 1997, Sleytr 1997). Субъединицы S-слоя соединены со слоем пептидогликана или с псевдомуреином у архей и грамположительных бактерий. Субъединицы связаны с компонентами липополисахаридов (LPS) в грамотрицательных бактериях (Sára and Sleytr 2000).

Предполагается, что единственным компонентом клеточной стенки, связанным с мембраной цитоплазмы у архей, является Slayer (König, Rachel et al. 2007). Он представляет собой простейший белок из архейных оболочек и бактерий (Sára and Sleytr 2000); кроме того, благодаря наличию около 10% белковых клеток у бактерий и архей, они представляют захватывающий прототип для исследования клеток во время роста и деления клеток и эволюционных ассоциаций (Whitman 1998, Sleytr, Huber et al. 2007). Внеклеточные полимерные вещества (EPS) опосредуют контакт между клеткой и источником сульфидной энергии, играя ключевую роль в формировании органической пленки и взаимодействиях на бактериальной основе (Savage and Fletcher 1985). состоит из полисахаридов, белков, липидов и нуклеиновых кислот, с различным количеством и составом в различных источниках энергии (Gehrke, Telegdi et al. 1998). A. ferrooxidans ATCC 23270Больше было отмечено увеличение EPS в среде, содержащей пирит или серу по сравнению с двухвалентным железом (Gehrke, Telegdi et al. 1998). Внеклеточные полисахариды (EPS) связаны с комплексообразованием с ионами железа (III) (Sand и Gehrke 2006, Klingl, Moissl-Eichinger et al. 2011). Количество сил адгезии и прикрепленных клеток уменьшается в отсутствие EPSin A. ferrooxidans ATCC 23270 (Li, Wang et al. 2016). Такие факторы, как pH, источник энергии, влияют на свойства поверхности клетки; поэтому разные культуры демонстрировали различные силы адгезии к одному и тому же субстрату (Li, Wang et al. 2016). Связывание железа не происходит случайным образом (Sand and Gehrke 2006), корреляция между количеством ионов железа (III), образующих комплекс в пределах прикрепления клеток EPS и FeS2, была объявлена ​​для штаммов A. ferrooxidans R1 и SPIII / 3 (Sand and Gehrke 2006) ).

Различные методы электронной микроскопии, такие как негативное окрашивание, метод сублимационного травления, предоставляют значительную информацию о сетчатой ​​структуре S-слоя (Messner, Pum et al. 1986, Rachel 1999). В качестве филогенетического подхода общие признаки поверхностного слоя, такие как симметрия и размерность, могут быть использованы для выяснения таксономического положения организма с помощью электронной микроскопии (König, Rachel et al. 2007, Klingl, Moissl-Eichinger et al. 2011). Высокое разрешение методов травления замораживанием как лучший метод для рассмотрения структуры s-слоя и жгутиков у свежих, немытых интактных бактерий (Sleytr, Schuster et al. 2014). Выделение S-слойных бактерий белками, разрушающими водородные связи, приводит к перекристаллизации в мономолекулярные или двухслойные массивы в суспензии, они представлены либо в форме плоских листов, либо цилиндров с открытым концом (Sleytr, Huber et al. 2007) (Jarosch , Egelseer et al. 2001); Кроме того, некоторые нативные бактериальные штаммы теряют способность продуцировать S-слои из-за недостатка плазмид во время длительного лабораторного культивирования (Jarosch, Egelseer et al. 2001, Blecha, Zarschler et al. 2005), чтобы преодолеть эти трудности, S-layer белки будут гетерологично экспрессироваться в эукариотических системах, таких как [PIY3 (Ahmad, Hirz et al. 2014). Стабильность экспрессируемого белка была доказана у дрожжей (Blecha, Zarschler et al. 2005). Белки ObjectivesSurface слоя штаммов Acidithiobacillus SP5 / 1 и HV2 / 2 будут выделены и локализованы в:

 
• Уточнить филогенетическое положение этих двух штаммов

 

• Сравнение общих характеристик обоих штаммов с другими видами Acidithiobacillus

AS описание, данное (Kelly and Wood 2000) Acidithiobacillus ferrooxidans SP5 / 1, является членом вида Acidithiobacillus caldus; однако, растет в среде с Fe2 + в качестве единственного энергетического субстрата и окисляющим пиритом, что позволяет классифицировать штамм SP5 / 1 в соответствующем новом виде «Candidatus Acidithiobacillus striatothermus». Существование S-слоя было доказано в штамме SP5 / 1 (Klingl, Moissl-Eichinger et al. 2011). Кроме того, мы предполагаем, что белок Afe_2303 имеет предполагаемое сходство с белком поверхностного слоя в A. ferrooxidans ATCC 23270 (Klingl, Moissl-Eichinger et al. 2011). При изучении структуры S-слоя филогенетическое положение обоих штаммов будет выяснено, однако, изучая природу полосообразных у этих двух штаммов и сравнивая взаимные признаки с другими теми же видами, можно было бы получить более подробную информацию для классифицировать виды Acidithiobacillus. Дизайн исследования, методы и процедуры

 
1. Бактериальный штамм будет использоваться в этом исследовании следующим образом: штаммы Acidithiobacillus ferrooxidans SP5 / 1 были выделены в 1984 году из вулкана Solfatara, Pisciarelli в Италии, а пробы Acidithiobacillus sp. HV2 / 2 были взяты из Hveravellier, Island, и были выделены в 1986 г. доктор мед. Харальд Хубер из Университета Регенсбурга.

 

2. Штаммы и условия культивирования. Оба штамма Acidithiobacillus SP5 / 1 и HV2 / 2 будут культивировать в среде 9-K (Silverman and Lundgren 1959), содержащей 125 г пирита, в колбах Эрленмейера. PH среды будет доведен до 2,5 с помощью 50% серной кислоты и будет инкубирован на роторном инкубаторе при 150 об / мин при оптимальных температурах роста 30 ° C для штамма SP5 / 1 и 45 ° C для штамма HV2 / 2 для 72 ч. В этом исследовании будут использованы A. ferrooxidans ATCC 23270, A. caldus DSM 8584. Между тем, в качестве контроля будет использован дефицитный лабораторный штамм A. ferrooxidans SP5 / 1. Рост и морфология обоих штаммов будут контролироваться с помощью световой микроскопии, подсчитываться с помощью камеры для подсчета клеток Тома.

 

3. Электронная микроскопия. Придатие образцов будет исследовано методом отрицательного окрашивания, методом лиофильного травления. Клетки будут депонированы на золотых сетках с углеродным покрытием и подвергнуты отрицательному окрашиванию 2% (вес / объем) уранилацетата, рН 4. 5. Клетки бактерий будут фиксированы с помощью 1. 25% глутарового альдегида в течение 15 минут, после чего следует центрифугирование при 20000 × g в течение 10 мин и ресуспендируют в 50 мкл остаточной среды. Клетки будут собирать методом центрифужного замораживания-травления, после чего следует замораживание под высоким давлением на золотоносных носителях способом замораживания-травления согласно (Klingl, Moissl-Eichinger et al. 2011).