Сочинение на тему Гибридизация флуоресценции in situ: генетическая диагностика и исследования на клеточной основе

Флуоресцентная гибридизация in-situ (FISH) – это метод молекулярной диагностики, который позволяет визуализировать определенные последовательности нуклеиновых кислот хромосом в клеточном препарате. Он включает использование точного отжига флуоресцентно-меченного ДНК-зонда для комплементарных целевых последовательностей. Таким образом, интересующие гены / последовательности можно наблюдать визуально с использованием флуоресцентного микроскопа. Основными компонентами FISH являются целевая последовательность ДНК и ДНК-зонд. Прежде чем гибридизация может произойти, ДНК-зонд должен быть помечен с использованием различных средств, например: случайное праймирование, ник-трансляция или полимеразная цепная реакция. Для маркировки можно использовать две разные стратегии: прямой метод и косвенный метод.

При непрямой маркировке ДНК-зонд метят измененным нуклеотидом, который содержит гаптен, в то время как используются непрямые метки нуклеотидов, которые были напрямую изменены для содержания флуорофора. Эти флуоресцентно меченные зонды, т.е. зонды FISH сначала денатурируют, а затем комбинация денатурированного зонда и последовательности-мишени позволяет комплементарным последовательностям ДНК отжигаться. Для зондов, которые были помечены косвенно, требуется дополнительная стадия для визуализации нефлуоресцентного гаптена, который часто использует ферментативную / иммунологическую систему обнаружения. Хотя FISH быстрее при использовании зондов с прямой меткой, косвенная маркировка имеет преимущество в усилении сигнала благодаря использованию многочисленных слоев антител, и, таким образом, может иметь место более яркая продукция сигнала по сравнению с фоновыми уровнями.

Благодаря своей способности обнаруживать хромосомные аберрации, такие как перестройка генов, делеция генов и амплификация генов, а также его высокая специфичность; Процедуры FISH широко используются в молекулярной диагностике для выявления и идентификации:

 
• Центромеры конкретной хромосомы.

 

• Специфичные онкогены (локус-специфический зонд, полезный для (ROS1, ALK), амплификации (HER-2), делеции (CLL) и т. д.).

 

• Специфические гены-супрессоры опухолей (локус-специфический зонд, потеря связана с прогрессированием опухоли)

 

• Цельные хромосомы (полезно для выявления сложных хромосомных перестроек).

Процедуры FISH обычно проводятся на тканевых или клеточных препаратах FFPE (фиксированный формалином в парафине). Преимущества анализа FISH по сравнению с обычным хромосомным анализом заключаются в следующем:

 
• Можно исследовать большое количество клеток (полезно для выявления остаточных заболеваний)

 

• Метафазные клетки не являются необходимыми, поэтому аберрации также можно обнаружить в неделящихся клетках (полезно при хроническом лимфолейкозе)

 

• FISH может быть выполнен за довольно короткое время

 

• Аберрации, которые слишком тонкие, чтобы быть обнаруженными с помощью обычного цитогенетического анализа, также могут быть идентифицированы

Большинство процедур FISH проводятся в темноте, чтобы избежать обесцвечивания (зонды очень чувствительны к свету). Слайды FISH наблюдаются под флуоресцентным микроскопом, оборудованным фильтрами возбуждения и дихроичного типа, специфичными для зонда. Процедура FISH, выполняемая во время стажировки, выглядит следующим образом:

 
1. Инкубируйте FFPE (фиксированная формалином парафиновая ткань) при 700 ° C в течение 3 часов. с последующей депарафинизацией в ксилоле в течение 10 минут (дважды)

 

2. Обезвоживание предметных стекол по 70%, 85% и 100% в течение 3 минут с последующей сушкой на воздухе

 

3. Погрузите слайды в 0,2 М HCL на 20 минут.