Измененная экспрессия гликанов на поверхности клеток может служить маркером различных заболеваний, включая рак и СПИД. Идентификация этих измененных гликанов может быть легко достигнута с использованием гликан-связывающих белков, в частности антител и лектинов. Поэтому всегда важно выявлять и выделять новые лектины с различной углеводной специфичностью, которые можно использовать в качестве диагностических маркеров различных заболеваний. Настоящее исследование описывает выделение и углеводную специфичность лектина из семян Calotropis gigantea. Calotropis gigantea lectin (CGL), показал неспецифичность группы крови и сильно ингибировался гликанами гликопротеина муцина. Осаждение сульфатом аммония неочищенного экстракта Calotropis gigantean приводит к концентрации гемагглютинирующей активности при насыщении 30-60%. Лектин сохранял свою активность при воздействии до 50 ° С в течение 1 часа. Поскольку Calotropis gigantean обычно используется в качестве лекарственного растения, лектин этого растения может использоваться для гематологических применений и для очистки гликопротеинов.
Введение
Различные ключевые биологические процессы, включая межклеточные взаимодействия, миграцию клеток, индукцию апоптоза, молекулярный перенос, активацию рецепторов, передачу сигнала и эндоцитоз, неизменно опосредуются углеводными лигандами (Zeng et al. 2012). Понимание как качественной, так и количественной экспрессии этих гликанов, которые имеют тенденцию изменяться при различных состояниях клетки, предоставляет полезную информацию о том, является ли клетка нормальной или больной, наряду с их механизмами. Среди различных молекул, которые распознают углеводы как качественно, так и количественно, есть лектины (Sharon and Lis 2004). Лектины представляют собой углеводы, связывающие белки неиммунного происхождения, которые распознают гликаны, которые специфически либо экспрессируются на поверхности клетки, либо свободны в растворах. Это свойство распознавания гликаном лектинов использовалось в различных областях наук о жизни (Sharon and Lis 2004). Некоторые лектины специфически связываются с углеводами, ассоциированными с опухолью, и поэтому обладают потенциалом служить в качестве биомаркеров для дифференциации нормального и ракового состояния клеток млекопитающих. Многие из этих специфических гликанов считаются маркерами заболеваний и являются мишенями для диагностики, а также для терапии (Brockhausen I. 2006). Лектины из растительных источников были первыми белками этого класса, которые были изучены, и на сегодняшний день большинство изученных до сих пор лектинов в основном из растительных источников. Со времени открытия Стиллмарка в 1888 году первого лектина из клещевины была отмечена информация о многих лектинах практически из всех частей растений (Goldstein and Poretz 1986). Хотя многочисленные растительные лектины были изучены на предмет их большой структурной детализации, физиологическая роль этих белков все еще недостаточно изучена. В последнее время существует много спекулятивных ролей для растительных лектинов «в качестве запасных белков», «в качестве защитных молекул», в симбиозе. Ряд лектинов был выделен из тканей хранения в растениях (семена или вегетативные ткани хранения), где они составляют очень большую часть общего содержания белка в ткани (Van Damme et al. 1995). Некоторые растительные лектины участвуют в защитном механизме растений (Mirelman et al. 1975). Напротив, некоторые растительные лектины участвуют в расширении и узнавании клеточной стенки (Barre et al. 1996).
Учитывая применение лектинов в различных областях, таких как иммунология (Ashraf and Khan 2003), биология рака (Gastman et al. 2004), микробиология (Oppenheimer, Alvarez and Nnoli 2008), биология насекомых (Fitches et al. 2010) В настоящее время проводилась исследовательская работа для скрининга растений сорняков на наличие активности лектина и выделения из того же источника. В исследовании описывается выделение и частичная очистка лектина от Calotropis gigantea и его углеводная специфичность.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Семена Calotropis gigantea были собраны в марте месяце в ботаническом саду Карнатакского университета, Дхарвад. Семена были отделены и использованы для экстракции лектина, EDTA, трипсина, бычьего сывороточного альбумина (BSA), сульфата аммония, реагента Folin-Ciocalteau, додецилсульфата натрия, акриламида, N, N1-метилен-бис-акриламида, N, N, N1, N1-тетраметилэтилендиамин (TEMED) и бриллиантовый синий Commassie были из исследовательской лаборатории Sisco или из лаборатории Himedia, Индия. Сахара, использованные для исследований ингибирования гаптена, были получены от Sigma Chemicals, США. Все остальные химикаты, изделия из пластмассы, изделия из стекла относятся к аналитическим классам, если они не указаны с названиями компаний.
Методы
Экстракция лектина из семян Calotropis gigantea
Для экстракции лектина семена Calotropis gigantea собирали, промывали дистиллированной водой и высушивали. Затем семена гомогенизировали (5 г в 25 мл) с использованием ступки и пестика при комнатной температуре с забуференным фосфатом солевым раствором (рН 7,2; 100 мМ), содержащим 200 мМ ЭДТА и 200 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид). Процедуру экстракции проводили в течение ночи при 4ºC. Экстракт фильтровали через муслиновую ткань и осветляли центрифугированием при 8000 об / мин в течение 15 минут при 4ºC. Супернатант хранили при 4ºC до дальнейшего анализа. Аналогичная процедура была также принята для других семян растений.
Приготовление трипсинизированных эритроцитов
Кровь человека с различными группами крови (A, B и O) собирали в 1 мл 4% раствора цитрата натрия. Эритроциты отделяли центрифугированием при 1500 об / мин в течение 5 минут. Эритроциты промывали три раза солевым раствором и, наконец, в PBS и доводили до OD 2,5 при 660 нм. Измеряют общий объем и добавляют конечную концентрацию 0,025% трипсина и инкубируют при 37 ° С в течение 1 часа. Избыток трипсина удаляли повторным промыванием в солевом растворе и, наконец, доводили до OD 3,5 при 660 нм и использовали для анализа гемагглютинации и анализа ингибирования.
Анализ гемагглютинации (HA)
Для проведения анализа гемагглютинации использовали 96-луночные микропланшеты с U-образным дном. Первоначально 50 мкл физиологического раствора добавляли во все лунки соответствующих рядов. Затем в первую лунку каждого ряда добавляли 50 мкл раствора для анализа и проводили 2-кратное серийное разведение до 11-й лунки. С 11-й скважины было сброшено 50 миль. Трипсинизированные эритроциты каждой группы крови добавляли (50 мкл на лунку) в каждый ряд в чашке. Для каждой группы крови и образца лунка, содержащая только физиологический раствор и эритроциты, была включена в качестве отрицательных контролей. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа и визуализировали. Планшеты фотографировали и рассчитывали средние геометрические титры (GMT). Самое высокое разбавление экстракта, вызывающее видимую агглютинацию, произвольно рассматривалось как «титр», а минимальная концентрация белка, необходимая для агглютинации, рассматривалась как MCA, которая равна «одной единице гемагглютинирующей активности (1 HAU). Удельная активность гемагглютинации была выражается как активность в 1 мг (единицы мг -1) белка.
Анализ ингибирования гаптена
Анализы ингибирования проводили инкубацией образца лектина в последовательно разведенных сахаре / гликопротеинах перед добавлением эритроцитов в 25 мкл раствора для анализа. Самая низкая концентрация сахара / гликопротеина, которая ингибировала агглютинацию, была принята за ингибирующий титр гаптена. В 10-ю лунку вместо растворов сахара / гликопротеинов добавляют физиологический раствор, а в 11-й лунку вместо лектина добавляют физиологический раствор. Эти лунки служили как положительным, так и отрицательным контролем соответственно для исследований ингибирования. 12-я лунка служила регулярным контролем, который получал только 50 мкл физиологического раствора и суспензии эритроцитов. Лунки перемешивали и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем добавляли 50 мкл суспензии эритроцитов и дополнительно инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Наконец, ингибирование активности лектина визуализировали и фотографировали, как описано ранее, и определяли минимальную ингибирующую концентрацию (MIC), которая определяется как «самая низкая концентрация сахара / гликопротеина, который ингибировал агглютинацию» для каждого сахара / гликопротеина.
Влияние pH
Чтобы узнать оптимальный pH для активности лектина, лектин экстрагировали в другом буфере с различным pH. Для экстракции использовали ту же процедуру, как описано выше, содержащую соответствующие ингибиторы протеазы и хлорид натрия. Различные буферные системы, используемые для получения желаемого рН, представляют собой ацетат натрия (рН 4,0), фосфатный буфер (рН 7,2) и карбонатный буфер (рН 9,5). После экстракции чистый экстракт использовали для определения активности лектина с использованием трипсинизированных эритроцитов.
Осаждение сульфата аммония
Неочищенный экстракт подвергали осаждению на 0-30, 30-60 и 60-90% сульфата аммония [(NH4) 2SO4]. Сульфат аммония добавляли при комнатной температуре и осажденные белки отделяли центрифугированием при 8000 об / мин в течение 30 минут. Супернатант сохраняли, а осадок (остаток) повторно растворяли в 2 мл PBS. Как осадок, так и супернатант подвергали интенсивному диализу против PBS, и активность гемагглютинации определяли во всех фракциях.
SDS-PAGE
Пробы белка из неочищенного экстракта и осаждения сульфата аммония разделяли на 15% акриламидном геле. Образец белка обрабатывали 6х SDS-буфером и кипятили в течение 5 минут при 100 ° С. Охлаждали и белок загружали в лунки и подвергали электрофорезу при 80 В в течение 4 часов. После завершения электрофореза гели окрашивали коммасси бриллиантовым синим R-250. Стандартная белковая лестница с молекулярной массой в диапазоне 14,3-97,4 кДа была также обработана и подвергнута электрофорезу в аналогичных условиях.
Оценка белка
Содержание белка на различных этапах, включая неочищенные экстракты, оценивали в соответствии с протоколом, описанным Lowry et al. (LOWRY et al. 1951).
Результаты
Среди различных семян растений сорняков только семена Calotropis gigantea продемонстрировали самую высокую активность гемагглютинации (Titre-16), как было определено методом серийного двукратного разбавления с использованием эритроцитов кролика (таблица 1). Помимо Calotropis gigantean семена Lantana Camara также проявляют гемагглютинационную активность, но с более низким титром (04). Поскольку максимальная активность гемагглютинации наблюдалась у растения Calotropis gigantean, были проведены дополнительные исследования с использованием этого растения для выделения лектина, анализа ингибирования гаптена и т. Д.
Гигантский лектин Calotropis (CGL) одинаково распознавал все эритроциты группы крови.
Поскольку эритроциты кролика агглютинировали, для анализа использовали следующие эритроциты группы крови человека А, В и О, и было обнаружено, что CGL не различает эритроциты группы крови А, В и О. Однако лектин связывался с различной интенсивностью и распознавал эритроциты группы крови «О» с максимальным титром (64), а эритроциты группы крови «В» с наименьшим титром (08). Эти результаты представлены на рис. 1. Для дальнейших исследований использовались эритроциты группы крови O из-за легкой доступности эритроцитов.
CGL-лектин сильно ингибируется гликопротеинами муцина.
Для определения углеводной специфичности лектина для анализа ингибирования гаптена использовали различные моносахариды, дисахариды и гликопротеины. Список различных сахаров и гликопротеинов, использованных для этого анализа, приведен в таблице 2. Как показано на фиг.2, активность гемагглютинации лектина CGL была сильно ингибирована муцином, а затем фетуином. Активность лектина не была ингибирована ни одним из протестированных моносахаридов и дисахаридов. Эти результаты показывают, что лектин не является специфичным для простых сахаров, но распознает сложные сахара, которые присутствуют в гликопротеинах муцина или фетуина. Это может быть еще одной причиной, по которой этот лектин является неспецифической группой крови.
Лектин стабилен при разных температурах.
Чтобы определить стабильность активности лектина при различных температурах, лектин экстрагировали и инкубировали при различной температуре в течение 1 часа, а затем определяли активность гемагглютинации. Как изображено на фиг.3, лектин проявлял устойчивую стабильность в своей активности от 40 до 60 ° С. Хотя титр снижался при 40-60 ° С, но такая же активность сохранялась в течение нескольких дней. Это может быть связано с инактивацией протеаз, которые присутствуют в экстракте. Кроме того, активность лектина также была стабильной в течение по меньшей мере 7 дней, когда он хранился при комнатной температуре.
Максимальная гемагглютинационная активность CGL была обнаружена при 30-60% насыщения сульфатом аммония.
Затем проводили осаждение неочищенного экстракта сульфатом аммония для фракционирования белков. Результаты осаждения сульфата аммония представлены на фиг.4. Результаты показывают, что концентрация лектина увеличилась в 30-60% осажденной фракции сульфата аммония, о чем свидетельствует повышенная активность гемагглютинации (титр-64). Из рисунка 4 видно, что некоторые загрязненные белки могут быть удалены на этом этапе. Фракция 0-30% показала некоторую гемагглютинационную активность с титром 08. Это может быть связано с остаточным присутствием лектина в этой фракции. Хотя хорошее количество белков было осаждено во фракции 60-80%, но оно не проявляло какой-либо гемагглютинационной активности.
SDS-PAGE анализ частично очищенного лектина.
Электрофорез в SDS-полиакриламидном геле неочищенных и осажденных сульфатом аммония фракций проводили для анализа количества белков, присутствующих в образцах. Как показано на фиг.5, после 30-60% осаждения сульфата аммония количество полос белков значительно уменьшилось (дорожка-3) по сравнению с сырым образцом (дорожка-1). Общие белковые полосы, которые присутствуют во всех фракциях, близки к молекулярной массе в диапазоне от 40 до 50 кДа. Это могут быть белковые полосы, которые могут быть связаны с активностью лектина.
Сложная очистка лектина.
Поскольку активность лектина увеличивалась в осажденной фракции сульфата аммония, кратное увеличение степени очистки лектина рассчитывали на основе удельной активности пре …
Мужчины очень долго правили в индустрии фитнеса. Не удивительно, что женщины в равной конкуренции соревнуются с мужчинами в индустрии фитнеса. Они также ищут идеальное тело,
Анализ мыльных опер. Краткая история Жанр мыльной оперы появился на американском радио в 1930-х годах и получил свое название благодаря спонсорской поддержке программ крупными компаниями,
Есть несколько разных циклов, вокруг которых вращается Земля. Некоторые из циклов были затронуты катастрофой Фукусима-Дайхатсу. Завод в Фукусиме пострадал от землетрясения силой 9,0 балла. Растения,