Аденозин-5’-трифосфат (АТФ) является основной энергетической валютой клеток и участвует в многочисленных клеточных процессах. Мониторинг гидролитической активности АТФ в клетках будет полезен для понимания клеточных процессов, потребляющих АТФ, и поможет выяснить способ действия и регуляцию вовлеченных ферментов. До настоящего времени сообщалось о количестве флуоресцентных датчиков для этой цели, но до настоящего времени нет доступных методов для мониторинга гидролиза АТФ в живых клетках в режиме реального времени. В связи с этим был разработан и синтезирован новый флуорогенный зонд АТФ. При ферментативном гидролизе эта молекула демонстрирует увеличение интенсивности флуоресценции и времени жизни флуоресценции, что обеспечивает считывание ее гидролиза и, таким образом, может использоваться для мониторинга процесса, включающего использование АТФ. Мы использовали конфокальную флуоресцентную и флуоресцентную микроскопию продолжительности жизни (FLIM) для мониторинга гидролиза аналога АТФ, Атто 488-аденозинтетрафосфат-гаситель (Ap4), в живых клетках. Наши результаты показывают, что Ap4 гидролизуется в лизосомах и аутофагосомах. Наши исследования показывают, что флуоресцентная микроскопия может быть направлена на визуализацию в живых клетках распределения аутофагосом и лизосом и аутофагического потока с использованием Ap4 без необходимости избыточной экспрессии флуоресцентно меченных белков в клетках.
Большинство химических реакций, происходящих в биологической системе, энергетически неблагоприятны и, следовательно, требуют ферментных катализаторов и связаны с гидролизом АТФ, который служит источником энергии. Помимо поставщика энергии, АТФ требуется для различных других клеточных процессов. АТФ действует как кофактор переноса фосфата киназами в процессе фосфорилирования белка и обеспечивает энергию для конформационного изменения моторных белков. АТФ также является исходной молекулой для образования важных мессенджеров, таких как цАМФ (циклический аденозинмонофосфат), циклический ди-АМФ, диаденозинтрифосфат (Ap3A) и диаденозин тетрафосфат (Ap4A). АТФ играет ключевую роль в энергетике, метаболических путях, ферментативной регуляции и механизме трансдукции клетки. Количество АТФ прямо пропорционально определенным физиологическим состояниям клетки, а также признаку некоторых метаболических нарушений. Таким образом, визуализация АТФ в этих путях предоставит важную информацию для всестороннего понимания процессов, связанных с АТФ и определенных физиологических расстройств. Много различных методов было установлено для измерения оборота АТФ в сверхурочное время. Они основаны на радиоактивном мечении АТФ, спектроскопическом обнаружении высвобожденного фосфата путем образования молибденового синего или образования комплексов с малахитовым зеленым. Однако эти процессы требуют очистки продуктов реакции перед анализом, и, таким образом, в реальном времени и непрерывное измерение гидролиза АТФ невозможно.
Кроме того, их применение в клетках ограничено либо потому, что они не принимаются большинством клеточных ферментов, либо им необходима сверхэкспрессия другого флуоресцентно-меченного белка. По этой причине были разработаны новые методы, основанные на спектроскопическом измерении продуктов реакции по ферментативному обороту АТФ.
Недавно были разработаны и синтезированы некоторые новые флуорогенные АТФ-зонды. Эти аналоги флуорогенных нуклеотидов были использованы для прямого контроля ферментативной активности без использования какого-либо другого реагента. Нуклеотидные аналоги разработаны как зонды FRET и помечены двумя химическими группами: флуоресцентным красителем, который действует как донор FRET, и другой молекулой, которая действует как акцептор FRET. [12] Таким образом, в интактной молекуле происходят внутримолекулярные FRET-треки, и при расщеплении нуклеотида донорный флуорофор пространственно отделяется от акцепторного флуорофора, и передача энергии прекращается. Это приводит к увеличению интенсивности флуоресценции, а также увеличению времени жизни флуоресценции донорного флуорофора, который количественно определяют для измерения его гидролиза. Этот подход был успешно использован для изучения активности убиквитин-активирующего фермента UBA, фосфодиэстеразы I C. adamenteus (SVPD) и для выяснения АТФ-зависимого метаболизма ацетона в бактериальных экстрактах D. biacutus.
Большинство предыдущих исследований были посвящены изучению гидролиза АТФ в различных системах in vitro. Мы провели мониторинг путей потребления клеточной АТФ в живых клетках с высоким пространственным и временным разрешением с использованием различных методов флуоресцентной микроскопии. Мы использовали конфокальную и FLIM-FRET микроскопию для мониторинга гидролиза Ap4. Флуоресцентная визуализация времени жизни (FLIM) – это подход к измерению FRET, который обнаруживает сигнал флуоресценции донора с разрешенным временем, а время жизни донора дает прямую меру переноса энергии. Время жизни флуоресценции является характерным свойством флуорофора и в определенной степени не зависит от интенсивности возбуждения, изменений концентрации и фотообесцвечивания. Мы продемонстрировали, что Ap4 используется в лизосомах, как видно из колокализационных исследований флуоресценции Ap4 с маркером лизосом. Значительное снижение гидролиза Ap4 наблюдалось, когда клетки обрабатывали макролидным антибиотиком бафиломицином A1, мощным ингибитором лизосомальной H + -АТФазы или хлорохина, слабого лизомотропного основания, которое дезактивирует лизосомальные ферменты. Активность гидролиза Ap4 показывает сильную количественную корреляцию с процессом клеточной аутофагии. Наши исследования показывают использование Ap4 во время процесса аутофагии, как показывает колокализация маркеров аутофагии LC3B-RFP и точечного гидролиза Ap4. Мы предлагаем использовать Ap4 в качестве хемосенсора для мониторинга аутофагического потока в живых клетках.
После синтеза соединения Ap4 мы визуализировали его гидролиз в реальном времени путем измерения времени жизни флуоресценции после включения в живые клетки. Этот подход основан на наблюдении передачи энергии резонанса Форстера (FRET) между двумя флуорофорами. После гидролиза FRET может быть количественно определен путем измерения уменьшения времени жизни флуоресценции донора, и это один из наиболее эффективных и быстрых методов измерения FRET. Время жизни измерялось на широкоугольном микроскопе для каждого пикселя одновременно. Значительное увеличение времени жизни флуоресценции (фазы) наблюдалось с течением времени в результате ферментативного гидролиза Ap4. Насколько нам известно, это первый раз, когда гидролиз аналога АТФ контролируется в живых клетках. Гидролиз Ap4 начинается, как только он вводится в клетки, и достигает устойчивого состояния примерно через 60 минут. Тем не менее, фактические клеточные компоненты и клеточный процесс, который использовал Ap4, все еще были неуловимы. Таким образом, позже была также использована конфокальная микроскопия для более точного пространственного разделения клеточных компонентов, использующих это соединение. Локализация гидролиза Ар4 в лизосомах: чтобы определить локализацию гидролиза А4 в живых клетках, использовались пятна органелл, такие как митотрекер и лизотрекер которые специфически маркируют митохондрии и лизосомы живых клеток соответственно.
Была обнаружена значительная колокализация между точечным гидролизом аналога Ap4 и лизосомами, что свидетельствует о том, что гидролиз аналогов Ap4 происходит в лизосомах. Когда клетки обрабатывали β-лапахоном, который повреждает лизосомы и индуцирует некроз, повышая уровни свободных радикулов, таких как H2O2 и O2 • -, наблюдается значительное снижение активности гидролиза Ap4, а также распределения флуоресценции в клетках. вырос. Увеличение распределения флуоресценции как красителя лизотрекинга, так и Ap4 также можно увидеть в результате разрыва лизосом. Это снова указывает на то, что лизосомы заметно вовлечены в гидролиз аналога Ap4.
Для дальнейшего подтверждения открытия были использованы еще два лизосомальных ингибитора. Хлорохин является лизосомотропным агентом, который ингибирует ферментативную активность, повышая рН внутри лизосом. Монопротонированная форма хлорохина диффундирует в лизосомы, где он подвергается дипротанированию и улавливается, изменяя таким образом pH лизосом и, таким образом, ингибируя активность лизосом. Бафиломицин А1 является макролидным антибиотиком, который используется в качестве ингибитора лизосомальной H + -АТФазы. Бафиломицин предотвращает подкисление эндосом и лизосом и, таким образом, ингибирует функционирование лизосом, включая аутофагический поток. Клетки обрабатывали возрастающими концентрациями обоих этих ингибиторов в течение ночи, а затем клетки визуализировали после включения аналога Ap4. Оба этих ингибитора привели к резкому снижению гидролиза Ap4 в живых клетках. Это показывает, что Ap4 используется в лизосомах. Поскольку лизосомам требуется огромное количество энергии для поддержания внутрипросветного низкого pH (4,2-5,3) по сравнению с цитоплазмой, весьма вероятно, что Ap4 используется для транспорта ионов H + и регуляции лизосомального pH с помощью V-ATPases. / р>
Мужчины очень долго правили в индустрии фитнеса. Не удивительно, что женщины в равной конкуренции соревнуются с мужчинами в индустрии фитнеса. Они также ищут идеальное тело,
Есть несколько разных циклов, вокруг которых вращается Земля. Некоторые из циклов были затронуты катастрофой Фукусима-Дайхатсу. Завод в Фукусиме пострадал от землетрясения силой 9,0 балла. Растения,
Этот эксперимент проводится для наблюдения за развитием эмбрионов перепелов в течение нескольких дней. Эмбрион перепела обычно развивается и выводится через 20-21 день. Мы провели эксперимент