Аннотация
Зеленый флуоресцентный белок (GFP) – это уникальный белок, который проявляет свою уникальность в спектре поглощения и флуоресценции, что позволяет нам обнаруживать белок. В этом эксперименте была использована рекомбинантная форма GFP, rGFP. Целью этого эксперимента было очистить и экспрессировать рекомбинантную форму GFP в штамме E.Coli, BL21 (DE3) (pLysS). Белок был помечен эпитопом His6 / Xpress на N-конце. Меченый His6 белок использовали во время процесса очистки и аффинной хроматографии на Ni + 2-агарозе. Эпитоп Xpress использовали в Вестерн-блоттинге с целью очистки и обнаружения. Ген GFPuv (УФ-оптимизированный) был сверхэкспрессирован, чтобы помочь в процессе определения активности белка. Мы смогли качественно подтвердить присутствие rGFP, используя ультрафиолетовый свет.
Введение
Присутствие флуоресцирующих клеток было подтверждено у вида медузы Aequorea Victoria в 1955 году. Осаму Шимомура выделил зеленый флуоресцентный белок из этого вида медузы в 1962 году (Chalfie et al.). Работы Мартина Чалфи и Дафласа Прашера пролили свет на важность этого белка и оказали значительное влияние на локализацию белка и молчание. Дуглас Прашер смог клонировать последовательность генов GFP в 1992 году, а Мартин Чалфи успешно экспрессировал GFP в C.elegans в 1994 году. Источником флуоресценции белка GFP был его хромофор. Хромофор, расположенный на внутренней стороне 11-ниточной B-образной структуры, является следствием автоциклизации Gly67, Ser65 и Tyr66 в присутствии кислорода (Rippel). Таким образом, белок способен поддерживать стабильность, когда сталкивается с изменениями, вызванными pH, восстановлением, окислением и температурой, а также химическими реагентами. GFP дикого типа имеет относительную молекулярную массу 27 кДа и состоит из 238 аминокислот (Rippel). Наблюдаемый цвет обусловлен длиной волны возбуждения GFP 395 нм и длиной волны излучения 510 нм. Гистидиновая метка связывается с никелем, присутствующим в химическом линкере во время аффинной хроматографии на Ni + 2-агарозе. Мы очищали наши образцы от примесей путем вымывания указанных примесей, пока белок был связан с колонкой. В этом эксперименте в рекомбинантном GFP, который использовался, было немного больше функций. В частности, богатая гистидином метка His6, которая была размещена на rGFP, позволяла нам избирательно очищать этот белок.
Чтобы подтвердить присутствие rGFP в образцах, использовали эпитоп Xpress. Эпитопы – это части антигена, которые распознает антитело. Однако эпитоп Xpress не встречается в природе и является синтетическим эпитопом.
Материалы и методы
Экспрессия rGFP в E.Coli
Среда для роста 10 мл LB содержит 100 мкг / мл Amp и 25 мкг / мл Cam. Штаммы G бактерий BL21pLysS, pRSETA-GFPUV, добавляли на бактериальные чашки LB для создания растущих колоний. Колонии выращивали в течение ночи до достижения мутного вида. Для добавления 10 мл жидкой питательной среды, содержащей колонию, готовили еще 500 мл жидкой ростовой среды LB – 100 мкг / мл ампер и 25 мкг / мл Cam в 1-литровой перегородке, предварительно нагретой до 30 ° C. Бактерии росли в течение ночи при 37 ° С. Образец энергично встряхивали до достижения желаемой плотности. Процесс продолжали до тех пор, пока образец не достигал OD 600 нм 0,5. Это когда начался процесс сбора урожая. 1 мл образца помещали в 1,5-центрифужную пробирку, центрифугировали и супернатант отбрасывали. Этот образец гранул G0 хранили в нем при -20oC для последующего анализа с использованием геля SDS-PAGE. Затем оставшуюся часть культуры использовали для индукции IPTG (изопропил -D-1-тиогалактопиранозид) (конечная концентрация 1 мМ). Каждый час до третьего часа отбирали образцы 1 мл. Эти образцы были помечены как G1, G2 и G3 и хранились в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл при -20 ° C для анализа в геле SDS-PAGE. 15 мл образца с третьего часа также было собрано. Этот образец хранили в центрифужной пробирке синего цвета объемом 15 мл. Этот образец маркировали G3-15 мл и центрифугировали. Супернатант выбрасывали и хранили при -20ºC.
Подготовка к GCE
Неочищенный экстракт rGFP (GCE) получают после процесса медленного замораживания-оттаивания, добавляя 1 мл буфера для разложения дважды. Разрушающий буфер содержит 10 мМ Трис, рН 8, 150 мМ NaCl. Этот разрушающий буфер пипетировали (P1000) в замороженный осадок бактерий. Раствор должен полностью раствориться, и буфер должен перемещаться вверх и вниз (с помощью пипетки) до тех пор, пока раствор не станет однородным. Затем раствор переносят в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и встряхивают в течение 5 минут. Затем раствор перемещали в водяную баню при 37ºC на 10 минут. Их инкубируют при 37ºC в сухом воздухе в течение 20 минут. Пробирку переворачивают вверх дном, чтобы супернатант переносился в чистую пробирку. Небольшое количество этого будет использовано как GCE.
Подготовка Ni2 + агарозы
Готовили колонку и в нее помещали 1 мл 50% -ной суспензии Ni2 + агарозы. Замок приманки оставался открытым, пока вся жидкость не прошла через него. Это называется гравитационная упаковка. Всего 5 мл разрушающего буфера добавляли в колонку для вымывания 20% этанола, содержащегося в Ni2 + агарозном геле. Процесс был остановлен, когда жидкость перестала вытекать из шприца.
Моет и элюирует
100 мкл GCE следует добавить в пластиковую пробирку для центрифугирования объемом 1,5 мл и сохранить; Маркируйте трубку GCE. Разбивающий буфер добавляли в исходную пробирку GCE до достижения 1 мл объема. Закройте приманку на колонке и добавьте GCE в колонку с агарозой Ni2 +. Подождите 5-20 минут, откройте приманку и соберите 0,5 м в пластиковую пробирку для центрифуги. Маркируйте эту трубку W1. Затем добавьте 0,5 мл разрушающего буфера и соберите 0,5 мл из люер-лок. Используйте 4,5 мл разрушающего буфера. Они будут помечены W2-W10. В этот момент эксперимент будет продолжен с этапом элюции. Для этой стадии будет использоваться элюирующий буфер, содержащий имидазол. Имидазол будет конкурировать с His6-меткой, высвобождая белки, связанные с колонкой Ni + 2. Концентрация этого буфера составляет (10 мМ Трис, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 300 мМ имидазол). Маркируйте 10 центрифужных пробирок E1-E10 и собирайте с шагом 0,5 мл из колонки. Используйте 10 5 мл буфера.
Брэдфордский анализ
Анализ Брэдфорда использовали для определения общей концентрации белка. Анализ делает это, обнаруживая присутствие пептидных связей в образце. Реагент, или реагент Брэдфорда, содержит краситель Кумасси синий. Когда представлен образец белка, краситель вызывает изменение цвета с красного на темно-синий. Изменение цвета наблюдается потому, что в белках краситель Кумасси синий реагирует с карбоксильными группами и первичными аминами в белке. Для эксперимента использовали известные количества бычьего сывороточного альбумина (BSA) с концентрацией 0,5 мг / мл. Готовили образцы, содержащие 0 мкг, 2 мкг, 4 мкг, 6 мкг, 8 мкг и 10 мкг BSA. Затем добавляли воду, чтобы образцы имели объем 50 мкл. Затем к этим образцам добавляли 200 мкл кумасси синего красителя. Образцы загружали в считывающее устройство для микропланшетов и инкубировали в течение десяти минут. Поглощение образцов затем измеряли при 595 нм с помощью спектрофотометра после десятиминутного периода инкубации с помощью спектрофотометра. Измеренные значения оптической плотности были использованы для получения стандартной кривой. Аналогичный процесс был применен для приготовления образца для промывки и элюирования (25 мкл образца + 25 мкл воды + 200 мкл кумасси синего), и поглощение этих образцов измерялось при 595 нм. После получения оптической плотности концентрации W1-W6 и E1-E6 экстраполировали.
SDS-PAGE и кумасси синий анализ фракций rGFP:
12% -ный разрешающий гель был приготовлен с использованием 2,7 мл воды, 3,2 мл 30% акриламида (29,2% мас. / об. акриламида, 2 мл 4x разрешающего буфера (0,75 трис рН 8,8, 04% SDS), 0,8% мас. / об. акриламид), 80 мкл 10% APS (персульфат аммония) и 5 мкл TEMED (тетраметилендиамин). За процессом следовало приготовление 5% штабелирующего геля с использованием 4,6 мл воды, 1,3 мл 30% акриламида (29,2% мас. / Об. Акриламида, 0,8% мас. / Об. Бис-акриламида), 2 мл 4х накопительного буфера (0,25 трис рН 6,8 , 0,4% SDS), 48 мкл 10% APS (персульфат аммония), 5 мкл TEMED.
Процесс подготовки и загрузки образцов был завершен после приготовления геля. Образцы были G0, G3, GCE, W2, W3, E3 и E4. Указанные количества G0 и G3 смешивали с 40 мкл и 80 мкл воды соответственно. За этим последовало добавление 20 мкл и 40 мкл 4xSLB (буфера для загрузки образца, содержащего 62,5 мМ трис, рН 6,8, 4,5% SDS, 0,05% об. / Об. B-меркаптоэтанола, 50% об. / Об. Глицерина и 0,01% об. / Об. Бромфенолового синего ). Исключая Е2 и Е3, образцы получали путем смешивания 30 мкл образцов с 10 мкл 4xSLB. Образцы E2 и E3 были приготовлены с использованием 45 мкл каждого образца, смешанного с 15 мкл 4xSLB. Все образцы встряхивали в течение десяти минут. Затем 15 мкл образцов загружали на дорожки (дорожки с гелем). Всего 5 мкл лестницы было добавлено для последней полосы движения. Перед загрузкой образцов гель помещали в емкость для электрофореза, содержащую 500 мл 1х буфера для электрофореза, используя 50 мл 10-кратного исходного раствора (30 г трис, 144 г глицина и 10 г SDS на литр) и 450 мл деионизированной воды. Гель проработали в общей сложности 45 минут при 200 В. После этого гель был разобран и окрашен кумасси синим красителем. Помощник преподавателя (TA) завершил процесс удаления пятен.
SDS-PAGE и вестерн-блот:
Для приготовления геля и электрофореза использовали тот же протокол. Передача шкатулка была подготовлена после этого шага. Вестерн-блот-переносящая мембрана, используемая для этого эксперимента, представляла собой нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану окрашивали 20 мл Ponceau S, инкубировали в течение 1-2 минут в качающемся движении и помещали в прозрачный контейнер. После инкубации проводили промывку с использованием деионизированной воды. Следующим шагом был этап стирки. 30 мл блокирующего раствора (5% обезжиренного сухого молока / трис-буферный солевой раствор (TBS) / 0,05% Твин-20) добавляли в контейнер и помещали на встряхивающую платформу на 30 минут. После этого этапа раствор отбрасывали и добавляли 7 мл раствора первичного антитела (раствор мышиного анти-Xpress эпитопа MAb, разведенный 1: 5000). Затем контейнер был помещен на качающуюся платформу еще на 45 минут. В течение этого времени мембрана переворачивалась каждые 15 минут. После этого был шаг мытья. Первичное антитело было выброшено и помещено обратно в его оригинальный контейнер в соответствии с указаниями инструктора лаборатории. 30 мл промывочного раствора (TBS / 0,05% Твин 20) добавляли к содержавшемуся и помещали на качающуюся платформу в общей сложности на 15 минут, переворачивая мембрану и заменяя раствор каждые 5 минут. За этим этапом следовало добавление 7 мл раствора вторичного антитела (овечьего антимышиного IgG-конъюгированного поликлонального анти-сывороточного раствора пероксида хрена, разведенного 1: 1500) и помещенного на качающуюся платформу на 45 минут. В течение этого времени мембрана переворачивалась каждые 15 минут. Затем раствор антитела помещали в исходный контейнер в соответствии с указаниями инструктора и этап промывки повторяли. Затем за этапом промывки следовал этап окончательного промывания 30 мл TBS и помещали на качающуюся платформу на 5 минут. 7 мл раствора субстрата тетраметилбензидина (TMB) использовали для создания мембраны. Мембрану погружали в воду и сушили бумажным полотенцем.
Результаты
Наличие rGFP во фракции E3 было подтверждено. Образцы показывают интересующий белок и стали возможными благодаря использованию искусственного эпитопа Xpress. Изменение цвета может быть связано с окислением, которое происходило в субстрате (пероксидаза хрена), конъюгированном со вторичным антителом. Субстрат служит средством качественного подтверждения присутствия rGFP в нитроцеллюлозной мембране.
Кроме того, результаты также указывают на то, что изопропил -D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) молекула, которая играет значительную роль в процессе индукции rGFP. Это связано с тем, что отсутствие IPTG означает, что экспрессия белка не будет оптимизирована. IPTG ингибирует Lac (лактозный) репрессор и приводит к тому, что lac-репрессор не способен связываться с промотором лактозы, что позволяет изобилие экспрессии РНК-полимеразы T7. Этот белок может преодолеть деградацию лизоцима и связывается с промотором T7, что позволяет экспрессию rGFP – представляющего интерес белка (Rippel).
Согласно рисунку 1, G0 указывает, что он не содержит никакого rGFP. Причина этого заключается в том, что в фазе роста 0 (G0) не было добавлено IPTG к образцу. Отсутствие IPTG в образцах G0 подтверждает ключевую роль IPTG в индукционном процессе. Однако G3 (фаза роста 3) содержит rGFP, поскольку IPTG присутствовал в образце в течение 3 часов в этот момент (Rippel).
Обсуждение и заключение
Эксперимент подтвердил, что IPTG играет существенную роль в экспрессии rGFP. Методы очистки и обнаружения, указанные в разделе «Материалы и методы», успешно привели к очистке интересующего белка.
Согласно рисунку 1 наличие rGFP обнаружено в образцах W2 и W3. Это может быть связано с «деградацией N-конца», которой страдают некоторые из rGFP. Это означает, что белок потерял метку His6, необходимую для связывания с колонкой с агарозой Ni2 +. Следовательно, эти белки вымывались вместе с другими примесями в образце.
Плохая методика также может быть связана с обнаружением rGFP в образцах W2 и W3. Соответствующий период ожидания (десять минут), необходимый для привязки His6 к колонке, возможно, не был должным образом соблюден после добавления неочищенного экстракта. Это может привести к обнаружению rGFP в образцах W2 и W3. Это также может привести к низкому выходу и чистоте образца, что видно на рисунке …
Мужчины очень долго правили в индустрии фитнеса. Не удивительно, что женщины в равной конкуренции соревнуются с мужчинами в индустрии фитнеса. Они также ищут идеальное тело,
Несмотря на то, что в клинических условиях много раз наблюдали преимущества эффекта плацебо у пациентов, внимательно изучая пациентов, проходящих лечение от болезни Паркинсона, лечения боли
Доставка кесарева сечения также называется доставкой кесарева сечения. Этот способ включает развертывание операции по доставке детей, то есть одного или нескольких. Роды кесарева сечения часто