Уникальный белок: зеленый флуоресцентный белок (GFP) сочинение пример

ООО "Сочинения-Про"

Ежедневно 8:00–20:00

Санкт-Петербург

Ленинский проспект, 140Ж

Сочинение на тему Уникальный белок: зеленый флуоресцентный белок (GFP)

Аннотация

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) – это уникальный белок, который проявляет свою уникальность в спектре поглощения и флуоресценции, что позволяет нам обнаруживать белок. В этом эксперименте была использована рекомбинантная форма GFP, rGFP. Целью этого эксперимента было очистить и экспрессировать рекомбинантную форму GFP в штамме E.Coli, BL21 (DE3) (pLysS). Белок был помечен эпитопом His6 / Xpress на N-конце. Меченый His6 белок использовали во время процесса очистки и аффинной хроматографии на Ni + 2-агарозе. Эпитоп Xpress использовали в Вестерн-блоттинге с целью очистки и обнаружения. Ген GFPuv (УФ-оптимизированный) был сверхэкспрессирован, чтобы помочь в процессе определения активности белка. Мы смогли качественно подтвердить присутствие rGFP, используя ультрафиолетовый свет.

Введение

Присутствие флуоресцирующих клеток было подтверждено у вида медузы Aequorea Victoria в 1955 году. Осаму Шимомура выделил зеленый флуоресцентный белок из этого вида медузы в 1962 году (Chalfie et al.). Работы Мартина Чалфи и Дафласа Прашера пролили свет на важность этого белка и оказали значительное влияние на локализацию белка и молчание. Дуглас Прашер смог клонировать последовательность генов GFP в 1992 году, а Мартин Чалфи успешно экспрессировал GFP в C.elegans в 1994 году. Источником флуоресценции белка GFP был его хромофор. Хромофор, расположенный на внутренней стороне 11-ниточной B-образной структуры, является следствием автоциклизации Gly67, Ser65 и Tyr66 в присутствии кислорода (Rippel). Таким образом, белок способен поддерживать стабильность, когда сталкивается с изменениями, вызванными pH, восстановлением, окислением и температурой, а также химическими реагентами. GFP дикого типа имеет относительную молекулярную массу 27 кДа и состоит из 238 аминокислот (Rippel). Наблюдаемый цвет обусловлен длиной волны возбуждения GFP 395 нм и длиной волны излучения 510 нм. Гистидиновая метка связывается с никелем, присутствующим в химическом линкере во время аффинной хроматографии на Ni + 2-агарозе. Мы очищали наши образцы от примесей путем вымывания указанных примесей, пока белок был связан с колонкой. В этом эксперименте в рекомбинантном GFP, который использовался, было немного больше функций. В частности, богатая гистидином метка His6, которая была размещена на rGFP, позволяла нам избирательно очищать этот белок.

Чтобы подтвердить присутствие rGFP в образцах, использовали эпитоп Xpress. Эпитопы – это части антигена, которые распознает антитело. Однако эпитоп Xpress не встречается в природе и является синтетическим эпитопом.

Материалы и методы

Экспрессия rGFP в E.Coli

Среда для роста 10 мл LB содержит 100 мкг / мл Amp и 25 мкг / мл Cam. Штаммы G бактерий BL21pLysS, pRSETA-GFPUV, добавляли на бактериальные чашки LB для создания растущих колоний. Колонии выращивали в течение ночи до достижения мутного вида. Для добавления 10 мл жидкой питательной среды, содержащей колонию, готовили еще 500 мл жидкой ростовой среды LB – 100 мкг / мл ампер и 25 мкг / мл Cam в 1-литровой перегородке, предварительно нагретой до 30 ° C. Бактерии росли в течение ночи при 37 ° С. Образец энергично встряхивали до достижения желаемой плотности. Процесс продолжали до тех пор, пока образец не достигал OD 600 нм 0,5. Это когда начался процесс сбора урожая. 1 мл образца помещали в 1,5-центрифужную пробирку, центрифугировали и супернатант отбрасывали. Этот образец гранул G0 хранили в нем при -20oC для последующего анализа с использованием геля SDS-PAGE. Затем оставшуюся часть культуры использовали для индукции IPTG (изопропил -D-1-тиогалактопиранозид) (конечная концентрация 1 мМ). Каждый час до третьего часа отбирали образцы 1 мл. Эти образцы были помечены как G1, G2 и G3 и хранились в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл при -20 ° C для анализа в геле SDS-PAGE. 15 мл образца с третьего часа также было собрано. Этот образец хранили в центрифужной пробирке синего цвета объемом 15 мл. Этот образец маркировали G3-15 мл и центрифугировали. Супернатант выбрасывали и хранили при -20ºC.

Подготовка к GCE

Неочищенный экстракт rGFP (GCE) получают после процесса медленного замораживания-оттаивания, добавляя 1 мл буфера для разложения дважды. Разрушающий буфер содержит 10 мМ Трис, рН 8, 150 мМ NaCl. Этот разрушающий буфер пипетировали (P1000) в замороженный осадок бактерий. Раствор должен полностью раствориться, и буфер должен перемещаться вверх и вниз (с помощью пипетки) до тех пор, пока раствор не станет однородным. Затем раствор переносят в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и встряхивают в течение 5 минут. Затем раствор перемещали в водяную баню при 37ºC на 10 минут. Их инкубируют при 37ºC в сухом воздухе в течение 20 минут. Пробирку переворачивают вверх дном, чтобы супернатант переносился в чистую пробирку. Небольшое количество этого будет использовано как GCE.

Подготовка Ni2 + агарозы

Готовили колонку и в нее помещали 1 мл 50% -ной суспензии Ni2 + агарозы. Замок приманки оставался открытым, пока вся жидкость не прошла через него. Это называется гравитационная упаковка. Всего 5 мл разрушающего буфера добавляли в колонку для вымывания 20% этанола, содержащегося в Ni2 + агарозном геле. Процесс был остановлен, когда жидкость перестала вытекать из шприца.

Моет и элюирует

100 мкл GCE следует добавить в пластиковую пробирку для центрифугирования объемом 1,5 мл и сохранить; Маркируйте трубку GCE. Разбивающий буфер добавляли в исходную пробирку GCE до достижения 1 мл объема. Закройте приманку на колонке и добавьте GCE в колонку с агарозой Ni2 +. Подождите 5-20 минут, откройте приманку и соберите 0,5 м в пластиковую пробирку для центрифуги. Маркируйте эту трубку W1. Затем добавьте 0,5 мл разрушающего буфера и соберите 0,5 мл из люер-лок. Используйте 4,5 мл разрушающего буфера. Они будут помечены W2-W10. В этот момент эксперимент будет продолжен с этапом элюции. Для этой стадии будет использоваться элюирующий буфер, содержащий имидазол. Имидазол будет конкурировать с His6-меткой, высвобождая белки, связанные с колонкой Ni + 2. Концентрация этого буфера составляет (10 мМ Трис, рН 8,0; 150 мМ NaCl, 300 мМ имидазол). Маркируйте 10 центрифужных пробирок E1-E10 и собирайте с шагом 0,5 мл из колонки. Используйте 10 5 мл буфера.

Брэдфордский анализ

Анализ Брэдфорда использовали для определения общей концентрации белка. Анализ делает это, обнаруживая присутствие пептидных связей в образце. Реагент, или реагент Брэдфорда, содержит краситель Кумасси синий. Когда представлен образец белка, краситель вызывает изменение цвета с красного на темно-синий. Изменение цвета наблюдается потому, что в белках краситель Кумасси синий реагирует с карбоксильными группами и первичными аминами в белке. Для эксперимента использовали известные количества бычьего сывороточного альбумина (BSA) с концентрацией 0,5 мг / мл. Готовили образцы, содержащие 0 мкг, 2 мкг, 4 мкг, 6 мкг, 8 мкг и 10 мкг BSA. Затем добавляли воду, чтобы образцы имели объем 50 мкл. Затем к этим образцам добавляли 200 мкл кумасси синего красителя. Образцы загружали в считывающее устройство для микропланшетов и инкубировали в течение десяти минут. Поглощение образцов затем измеряли при 595 нм с помощью спектрофотометра после десятиминутного периода инкубации с помощью спектрофотометра. Измеренные значения оптической плотности были использованы для получения стандартной кривой. Аналогичный процесс был применен для приготовления образца для промывки и элюирования (25 мкл образца + 25 мкл воды + 200 мкл кумасси синего), и поглощение этих образцов измерялось при 595 нм. После получения оптической плотности концентрации W1-W6 и E1-E6 экстраполировали.

SDS-PAGE и кумасси синий анализ фракций rGFP:

12% -ный разрешающий гель был приготовлен с использованием 2,7 мл воды, 3,2 мл 30% акриламида (29,2% мас. / об. акриламида, 2 мл 4x разрешающего буфера (0,75 трис рН 8,8, 04% SDS), 0,8% мас. / об. акриламид), 80 мкл 10% APS (персульфат аммония) и 5 ​​мкл TEMED (тетраметилендиамин). За процессом следовало приготовление 5% штабелирующего геля с использованием 4,6 мл воды, 1,3 мл 30% акриламида (29,2% мас. / Об. Акриламида, 0,8% мас. / Об. Бис-акриламида), 2 мл 4х накопительного буфера (0,25 трис рН 6,8 , 0,4% SDS), 48 мкл 10% APS (персульфат аммония), 5 мкл TEMED.

Процесс подготовки и загрузки образцов был завершен после приготовления геля. Образцы были G0, G3, GCE, W2, W3, E3 и E4. Указанные количества G0 и G3 смешивали с 40 мкл и 80 мкл воды соответственно. За этим последовало добавление 20 мкл и 40 мкл 4xSLB (буфера для загрузки образца, содержащего 62,5 мМ трис, рН 6,8, 4,5% SDS, 0,05% об. / Об. B-меркаптоэтанола, 50% об. / Об. Глицерина и 0,01% об. / Об. Бромфенолового синего ). Исключая Е2 и Е3, образцы получали путем смешивания 30 мкл образцов с 10 мкл 4xSLB. Образцы E2 и E3 были приготовлены с использованием 45 мкл каждого образца, смешанного с 15 мкл 4xSLB. Все образцы встряхивали в течение десяти минут. Затем 15 мкл образцов загружали на дорожки (дорожки с гелем). Всего 5 мкл лестницы было добавлено для последней полосы движения. Перед загрузкой образцов гель помещали в емкость для электрофореза, содержащую 500 мл 1х буфера для электрофореза, используя 50 мл 10-кратного исходного раствора (30 г трис, 144 г глицина и 10 г SDS на литр) и 450 мл деионизированной воды. Гель проработали в общей сложности 45 минут при 200 В. После этого гель был разобран и окрашен кумасси синим красителем. Помощник преподавателя (TA) завершил процесс удаления пятен.

SDS-PAGE и вестерн-блот:

Для приготовления геля и электрофореза использовали тот же протокол. Передача шкатулка была подготовлена ​​после этого шага. Вестерн-блот-переносящая мембрана, используемая для этого эксперимента, представляла собой нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану окрашивали 20 мл Ponceau S, инкубировали в течение 1-2 минут в качающемся движении и помещали в прозрачный контейнер. После инкубации проводили промывку с использованием деионизированной воды. Следующим шагом был этап стирки. 30 мл блокирующего раствора (5% обезжиренного сухого молока / трис-буферный солевой раствор (TBS) / 0,05% Твин-20) добавляли в контейнер и помещали на встряхивающую платформу на 30 минут. После этого этапа раствор отбрасывали и добавляли 7 мл раствора первичного антитела (раствор мышиного анти-Xpress эпитопа MAb, разведенный 1: 5000). Затем контейнер был помещен на качающуюся платформу еще на 45 минут. В течение этого времени мембрана переворачивалась каждые 15 минут. После этого был шаг мытья. Первичное антитело было выброшено и помещено обратно в его оригинальный контейнер в соответствии с указаниями инструктора лаборатории. 30 мл промывочного раствора (TBS / 0,05% Твин 20) добавляли к содержавшемуся и помещали на качающуюся платформу в общей сложности на 15 минут, переворачивая мембрану и заменяя раствор каждые 5 минут. За этим этапом следовало добавление 7 мл раствора вторичного антитела (овечьего антимышиного IgG-конъюгированного поликлонального анти-сывороточного раствора пероксида хрена, разведенного 1: 1500) и помещенного на качающуюся платформу на 45 минут. В течение этого времени мембрана переворачивалась каждые 15 минут. Затем раствор антитела помещали в исходный контейнер в соответствии с указаниями инструктора и этап промывки повторяли. Затем за этапом промывки следовал этап окончательного промывания 30 мл TBS и помещали на качающуюся платформу на 5 минут. 7 мл раствора субстрата тетраметилбензидина (TMB) использовали для создания мембраны. Мембрану погружали в воду и сушили бумажным полотенцем.

Результаты

Наличие rGFP во фракции E3 было подтверждено. Образцы показывают интересующий белок и стали возможными благодаря использованию искусственного эпитопа Xpress. Изменение цвета может быть связано с окислением, которое происходило в субстрате (пероксидаза хрена), конъюгированном со вторичным антителом. Субстрат служит средством качественного подтверждения присутствия rGFP в нитроцеллюлозной мембране.

Кроме того, результаты также указывают на то, что изопропил -D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) молекула, которая играет значительную роль в процессе индукции rGFP. Это связано с тем, что отсутствие IPTG означает, что экспрессия белка не будет оптимизирована. IPTG ингибирует Lac (лактозный) репрессор и приводит к тому, что lac-репрессор не способен связываться с промотором лактозы, что позволяет изобилие экспрессии РНК-полимеразы T7. Этот белок может преодолеть деградацию лизоцима и связывается с промотором T7, что позволяет экспрессию rGFP – представляющего интерес белка (Rippel).

Согласно рисунку 1, G0 указывает, что он не содержит никакого rGFP. Причина этого заключается в том, что в фазе роста 0 (G0) не было добавлено IPTG к образцу. Отсутствие IPTG в образцах G0 подтверждает ключевую роль IPTG в индукционном процессе. Однако G3 (фаза роста 3) содержит rGFP, поскольку IPTG присутствовал в образце в течение 3 часов в этот момент (Rippel).

Обсуждение и заключение

Эксперимент подтвердил, что IPTG играет существенную роль в экспрессии rGFP. Методы очистки и обнаружения, указанные в разделе «Материалы и методы», успешно привели к очистке интересующего белка.

Согласно рисунку 1 наличие rGFP обнаружено в образцах W2 и W3. Это может быть связано с «деградацией N-конца», которой страдают некоторые из rGFP. Это означает, что белок потерял метку His6, необходимую для связывания с колонкой с агарозой Ni2 +. Следовательно, эти белки вымывались вместе с другими примесями в образце.

Плохая методика также может быть связана с обнаружением rGFP в образцах W2 и W3. Соответствующий период ожидания (десять минут), необходимый для привязки His6 к колонке, возможно, не был должным образом соблюден после добавления неочищенного экстракта. Это может привести к обнаружению rGFP в образцах W2 и W3. Это также может привести к низкому выходу и чистоте образца, что видно на рисунке …

Поделиться сочинением
Ещё сочинения
Нет времени делать работу? Закажите!

Отправляя форму, вы соглашаетесь с политикой конфиденциальности и обработкой ваших персональных данных.