Введение
Диффузная крупная B-клеточная лимфома (DLBCL) – это гетерогенное заболевание с четко выраженными молекулярными особенностями и клиническим поведением (Hunt and Reichard 2008). Это самая распространенная из неходжкинских лимфом (Teras et al. 2016). Около 30-40 процентов неходжкинских лимфом являются DLBCL. На основании профилирования экспрессии генов можно выделить два основных класса DLBCL: это В-клетки герминативного центра (GCB) и активированные подтипы, подобные В-клеткам (ABC), с небольшим процентом (10-15%) классифицируемый (Ализаде и др., 2000; Суджоберт и др., 2016),
DLBCL обычно является агрессивным раком с медианной выживаемостью менее 12 месяцев у нелеченных пациентов. С 1970-х годов стандартным лечением был режим CHOP, состоящий из адриамицина, винкристина и циклофосфамида (McKelvey et al. 1976). Использование этого режима связано примерно с 40% выживаемости без прогрессирования заболевания и 50% долгосрочной выживаемости (Fisher et al. 1993). За последние несколько лет значительно улучшился прогноз DLBCL, главным образом благодаря включению ритуксимаба, моноклонального антитела против CD20 (Coiffier et al. 2002). Несмотря на эти заметные достижения, значительный процент пациентов имеют рефрактерную болезнь или будут рецидивировать, уменьшая их шансы на выживание (Coiffier et al. 2010).
Патогенез DLBCL является сложным, включающим взаимодействия между геномными и эпигеномными изменениями (Cerhan et al. 2014; Skibola et al. 2007). SLIT2 был классифицирован как основной ген-супрессор опухолей из-за его частой инактивации при различных типах рака, включая делецию или гиперметилирование его промотора (Gröne et al. 2006; Xian et al. 2001). SLIT2 играет роль в подавлении роста опухоли (Dallol et al. 2002; Qiu et al. 2011) посредством регуляции сигнальных путей β-catenin и PI3-K, ведущих к усилению клеток, опосредованных β-catenin и E-cadherin. межклеточная адгезия (Prasad et al. 2008).
В отношении гематолимфоидных злокачественных новообразований имеется лишь несколько сообщений о лейкемии и лимфоме мантийных клеток в отношении роли SLIT2 и его основного рецептора ROBO1 (Appe et al. 2017; Dunwell et al. 2009; Enjuanes et al. 2011). Эти сообщения показали частое метилирование SLIT2 в клеточных линиях лейкемии, а также в первичных образцах острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и хронического лимфолейкоза (CLL) (Dunwell et al. 2009). Более того, экспрессия SLIT2 была восстановлена после обработки ВСЕХ линий деметилирующим агентом (5-аза-2′-дезоксицитидином) (Dunwell et al. 2009). При лимфоме клеток Mantle ROBO1 демонстрирует высокий уровень метилирования, что хорошо коррелирует с его низкой экспрессией мРНК (Appe и др. 2017; Enjuanes и др. 2011), также коррелирует с агрессивными клинико-патологическими признаками и более коротким выживанием (Enjuanes et al. 2011 ). Здесь мы изучили экспрессию и статус метилирования гена SLIT2, а также его связь с исходом у пациента при DLBCL.
Материалы и методы
Это ретроспективное когортное исследование, которое было одобрено Комитетом по этике медицинских исследований Великобритании (North West-Haydock; ссылка 15 / NW / 0079).
Образцы тканей
Использовались фиксированные формалином парафиновые ткани от 108 пациентов с DLBCL, диагностированных в период с 1997 по 2012 год в Университетской больнице Бирмингема. Диагноз был подтвержден гистологическим обзором. Подробные клинические и последующие данные были доступны для всех пациентов. Период наблюдения составил от 1 до 180 месяцев, в среднем 45 месяцев. На основе алгоритма Ганса DLBCL были сгруппированы по IHC в типы GCB или ABC-DLBCL (Hans et al. 2004). Ткани миндалины, фиксированные формалином и залитые парафином, использовали в качестве положительного и отрицательного контроля для окрашивания SLIT2.
Immunohistochemistry
Залитые в парафин ткани разрезали на толщину 4 мкм и помещали на микрослайды X-tra Adhesive. Экспрессия белка SLIT2 определялась с помощью IHC. Вкратце, срезы тканей депарафинизировали и затем повторно гидратировали с помощью градуированных спиртов. Срезы погружали в предварительно нагретый ЭДТА (рН 8,0) на 20 минут. Эндогенная активность пероксидазы ингибируется в пероксиде водорода 0,3%, а сайты неспецифического связывания блокируются нормальной козьей сывороткой при комнатной температуре. Первичные мышиные моноклональные анти-SLIT2 [клон EPR2771; Abcam Ltd. 134166 USA; разводили в 1: 800), использовали в течение 1 часа. Отрицательное контрольное окрашивание проводили холодным PBS вместо первичного антитела
Анализ выражения SLIT2
Весь срез опухоли сканировали при низкой мощности, чтобы исследовать общую интенсивность окрашивания в опухолевых клетках DLBCL. Обнаружено, что белок SLIT2 экспрессируется как в цитоплазме опухолевых клеток, так и в мембране. Интенсивность оценивали путем сравнения интенсивности между опухолью и GC нормальной лимфоидной ткани (тонзиллярная ткань в качестве внешнего положительного контроля или остаточные GC в пораженном лимфатическом узле в качестве внутреннего положительного контроля).
Интенсивность экспрессии оценивали следующим образом: 0 = отрицательный, 1 = слабый, 2 = умеренный, сравнимый с нормальными зародышевыми центрами и 3 = сильный, присутствие клеток с окрашиванием, очевидно, сильнее, чем в нормальных GC. Процент окрашивания оценивали 4 (если более 75% опухолевых клеток были положительными), 3 (50-75%), 2 (25-50%) или 1 (<25%). Окрашивание оценивали как «низкую экспрессию», если интенсивность окрашивания цитоплазмы, умноженная на процент, была меньше или равна 4 (Qin et al. 2015; Tseng et al. 2015).
Повторный анализ данных по экспрессии генов
Данные были повторно проанализированы из ранее опубликованного набора данных (GSE10846), который измерял экспрессию генов у пациентов с DLBCL, которые получали терапию CHOP или R-CHOP (Lenz et al. 2008). Пакет программ проекта Bioconductor использовался для проведения квантильной нормализации на уровне зонда (Boldstad et al. 2003) и надежного анализа множества массивов (Irizarry et al. 2003) для необработанных файлов CEL. Пакет выживания R был использован для анализа выживаемости (http://www.r-project.org/).
Обработка бисульфитом и анализ метилирования-специфической ПЦР (MSP)
Случаи DLBCL были отобраны с переменной интенсивностью окрашивания SLIT2, а также B-клетками GC, экспрессирующими сильное окрашивание SLIT2. ДНК выделяли из фиксированных в формалине парафиновых образцов с использованием набора тканей QIAamp DNA FFPE (№ по каталогу 56404). Неокрашенные срезы (по 6 срезов в каждом случае) нарезали до толщины 8 мкм и помещали на микрослайды X-tra Adhesive. Парафиновый воск удаляли в ксилоле, а срезы погружали в этанол и промывали в дистиллированной воде. Срезы опухоли или GC соскребали с предметных стекол и помещали в раствор для расщепления протеиназой K, затем инкубировали при 90 ° C. Остаточные загрязнения были смыты. Затем ДНК элюировали в буфере ATE. Очищенную ДНК проверяли на спектрофотометре Nanodrop. ДНК хранилась при -200С.
Бисульфитную модификацию геномной ДНК проводили, как описано ранее [Tao et al. 1999; Тао и соавт. 2002). 50 нг бисульфитированной ДНК для каждого образца использовали для анализа метилирования-специфической ПЦР (MSP). Были разработаны и испытаны множественные наборы метилированных праймеров, нацеленные на промотор SLIT2. Была выбрана лучшая пара (m5 / m7) с четкой полосой метилирования, обратно коррелированной с экспрессией и не амплифицирующей какую-либо небисульфитированную ДНК. Набор праймеров MSP, использованный в исследовании: SLIT2m5: 5’-GATCGGTTTAGGTTGCGG C; SLIT2m7: 5′-AACAACTAAACATAACGCGCG. MSP выполняли в течение 38 циклов с использованием ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold® (Thermo Fisher Scientific) (Murray et al. 2010; Tao et al. 1999; Tao et al. 2002).
Статистические методы
Данные были проанализированы с использованием расширенной статистики IBM SPSS (Статистический пакет для социальных наук), версия 23 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). Числовые данные были описаны как средний или межквартильный диапазон или диапазон или среднее значение и стандартное отклонение, в зависимости от случая, а качественные данные были описаны как число и процент. Критерий хи-квадрат (точный критерий Фишера) использовался для изучения соотношения между качественными переменными в зависимости от ситуации. Анализ выживания проводился с использованием метода Каплана-Мейера. Сравнение двух кривых выживаемости проводилось с использованием теста логарифмического ранга. Многофакторный анализ был выполнен с помощью регрессионной модели Кокса для проверки независимых прогностических эффектов статистически значимых переменных на одномерный уровень с вычислением отношения рисков и его 95% доверительного интервала. Значение р менее 0,05 считалось статистически значимым. Все тесты были двусторонними. Общая выживаемость (ОС) рассчитывалась от даты установления диагноза до даты смерти или последующего наблюдения. Безрецидивная выживаемость (EFS) рассчитывалась от даты лечения до даты рецидива, смерти или последнего известного последующего наблюдения.
Результаты
Паттерн экспрессии белка SLIT2 в нормальной лимфоидной ткани и DLBCL
Иммуногистохимический анализ SLIT2 проводили как для нормальной лимфоидной ткани (миндалины), так и для первичной DLBCL. В нормальной лимфоидной ткани высокая экспрессия SLIT2 была ограничена зародышевыми центрами, и только несколько межфолликулярных лимфоцитов демонстрировали низкую экспрессию SLIT2. SLIT2 был локализован как в цитоплазме, так и в мембране опухолевых клеток DLBCL. Разные интенсивности экспрессии белка SLIT2 наблюдались в разных случаях; 41/108 случаев (38%) были оценены как сильные (оценка 3), 66/108 (61,1%) имели слабое окрашивание, которое было меньше, чем внутренний контроль (зародышевые центры) (оценка 1 и 2). Только один случай (1/108, 0,9%) был отрицательным (оценка 0). Типичные случаи DLBCL с различными уровнями экспрессии белка SLIT2. Из 108 случаев 49 (45,4%) имели тип GCB, в то время как 58 (53,7%) имели тип ABC-DLBCL. Один случай был не классифицирован из-за неубедительных результатов IHC. 55,1% (27 случаев) GCB DLBCL и 65,5% (38 случаев) ABC-DLBCL показали низкую экспрессию SLIT2. Не было значимой корреляции между субтипом и экспрессией белка SLIT2 (р = 0,27).
Связь между экспрессией белка SLIT2 и клинико-патологическими признаками
В нашем исследовании была обнаружена значимая корреляция между низкой интенсивностью SLIT2 и прогрессирующей клинической стадией (стадии 3 и 4 против 1 и 2; р = 0,041). Существовала тенденция к тому, чтобы случаи с низкой экспрессией SLIT2 ассоциировались с плохой прогностической группой, как это определено в Пересмотренном международном прогностическом индексе (R-IPI) (p = 0,099). Никаких существенных связей между экспрессией белка SLIT2 и другими параметрами обнаружено не было.
Влияние экспрессии белка SLIT2 на выживаемость пациентов с DLBCL
Затем оценивали экспрессию белка SLIT2 на предмет его влияния на исход пациента. Однофакторный анализ Каплана-Мейера (KM) выявил значительное снижение общей выживаемости (ОС) у пациентов с DLBCL с низким уровнем белка SLIT2 со средним значением 28 месяцев, в то время как средняя выживаемость не была достигнута у пациентов с сильной экспрессией SLIT2 (p = 0,044). В многомерном анализе SLIT2 был независимым значимым предиктором ОС (p = 0,012). Хотя средняя EFS составляла всего 12,6 месяца для пациентов с низкой экспрессией опухоли SLIT2, по сравнению с 88,9 месяцами для пациентов с сильной экспрессией SLIT2, это различие не было статистически значимым (p = 0,11). Мы также оценили влияние экспрессии белка SLIT2 на исход отдельно для пациентов с каждым из подтипов DLBCL. Мы не обнаружили никакой корреляции между экспрессией белка SLIT2 и OS или EFS у пациентов с GC- (p = 0,26 и p = 0,35 соответственно) или ABC-DLBCL (p = 0,26 и p = 0,31 соответственно).
Экспрессия гена SLIT2 предсказывает выживаемость у пациентов с DLBCL (подтип ABC), получавших R-CHOP
Для дальнейшего изучения потенциального влияния экспрессии SLIT2 на исход мы использовали набор данных, ранее опубликованный Lenz et al. (2008) (GSE10846), который измерял экспрессию генов в опухолевой ткани 181 пациента с DLBCL, получавших либо CHOP, либо R-CHOP и который использовал экспрессию гена микроматрицы для определения подтипа (Lenz et al. 2008). Мы обнаружили, что низкая экспрессия мРНК SLIT2 достоверно коррелировала с ухудшением ОС у пациентов с ABC DLBCL, получавших R-CHOP (p = <0,01). Экспрессия SLIT2 достоверно не коррелировала с OS или EFS у пациентов с подтипом GC.
Метилирование промотора SLIT2 в DLBCL
Мы измерили метилирование промотора SLIT2 в 27 случаях DLBCL с различной экспрессией белка SLIT2, а также в двух наборах клеток GC B с высокой экспрессией SLIT2, 14/27 (52%) DLBCL имели низкую экспрессию белка SLIT2 и 13/27 (48). %) сильное выражение.
Более высокое метилирование SLIT2 (сильное / умеренное) было обнаружено в случаях со сниженной экспрессией белка SLIT2, и это было статистически значимо (p = 0,018). В образцах с низкой / отрицательной экспрессией SLIT2 12/14 (85,7%) имели статус сильного / умеренного метилирования. С другой стороны, среди образцов с более высокой экспрессией SLIT2 8/13 (61,5%) имели статус слабого / неметилирования, в то время как только 5/13 (38,5%) имели статус сильного / умеренного метилирования. В отличие от двух расщепленных GC с сильной экспрессией белка SLIT2, обнаружен неметилированный ген SLIT2. В этой небольшой серии не было статистически значимой корреляции между метилированием SLIT2 и подтипами DLBCL (4/16 ABC-DLBCL и 6/11 GCB DLBCL имели слабый / неметилированный статус; точный критерий Фишера, p = 0,24).
Ваше тело похоже на машину, в которой множество деталей работают вместе, чтобы машина работала плавно. Ваш мозг является центральной частью вашей машины. Это всего 2%
Укрепление здоровья – это укрепление здоровья в надежде, что люди прислушаются и изменят свое здоровье в лучшую сторону. Это важно, потому что реклама воздействует на
Некоторые исследования проводятся в Индии по вопросам, связанным с воздействием радиации на здоровье, излучаемым вышками мобильных телефонов и мобильных телефонов. Кафедра генетики человека, Университет