Фон:
После открытия и использования технологии кластеризованных регулярных межпространственных коротких палиндромных повторов (CRISPR) в качестве метода редактирования генома, его потенциал как тип клинической терапии для генетически связанных заболеваний, таких как различные формы рака, вызвал большое волнение в медицинском сообществе. Первоначально полученный из бактерий как иммунный ответ против вирусных агентов, CRISPR стал одним из наиболее перспективных инструментов для модификации генома человека (Sontheimer EJ et al, 2015, Human Gene Therapy). Технология CRISPR позволяет осуществлять точную и целевую модификацию генома путем делеции, вставки и регуляции в широком ассортименте клеток (Doudna JA and Charpentier E, 2014, Science). По состоянию на 2013 год исследователи смогли изолировать этот механизм от бактерий и применить его для успешного редактирования человеческих клеток, тем самым вызывая большие надежды среди тех, кто хочет взять CRISPR у постели пациента и интегрировать его в свои планы лечения (Балтимор Д, 2015, Наука). Генная терапия до открытия CRISPR включала лечение генных продуктов с помощью добавок дикого типа и как таковая была ограничена количеством излечимых заболеваний. CRISPR, с другой стороны, включает в себя модификацию самого генома, и поэтому считается, что он обладает большим потенциалом в отношении персонализированного клинического лечения (Sengillo JD, 2017, Genes).
Первоначально обнаруженная в 1987 году в Escherichia coli как прокариотический иммунный ответ, функция технологии CRISPR совпадает с геном Cas, который кодирует эндонуклеазы, ответственные за расщепление последовательностей ДНК-мишени, с помощью небольшой направляющей РНК (Ishino Y et al, 1987, Journal бактериологии). Небольшая направляющая РНК функционирует посредством спаривания оснований Уотсона-Крика с последовательностью ДНК-мишени и, как таковая, обеспечивает большую специфичность в отношении редактирования генома по сравнению с предыдущими методами, которые включали рекрутирование белкового комплекса для распознавания сайтов ДНК (Li X et al. , 2017, Hum Genet.). Малая направляющая РНК, используемая фрагментом CRISPR-Cas9, образуется как комплекс между обработанной РНК CRISPR (crRNA) и необходимой вспомогательной транс-активирующей РНК (tracrRNA), ответственной за процессинг crRNA (Ran FA, 2013, Nature Protocols). На рисунке № 1 показана модель CRISPR-Cas9 и ее функционирование для изменения генома организма.
Существует два основных класса CRISPR, использующих различные типы клеточных технологий, каждый из которых зависит от количества белков Cas, необходимых для модификации генома; Система CRISPR класса 1 включает типы I, III и IV и классифицируется вместе для использования их субъединиц в их эффекторных комплексах. Системы CRISPR класса 2, с другой стороны (включая типы II, V и VI), сгруппированы для использования одной субъединицы в своих эффективных комплексах, что облегчает управление ими в отношении модификации генома (Макарова М.С. и др., 2015 , Природа обзоры микробиологии). Более конкретно, система CRISPR типа II включает автономное использование эндонуклеазы Cas9 и, следовательно, является основной системой, которая использовалась в генной инженерии, управляемой РНК (Lander ES, 2016, Cell).
Рак толстой кишки:
Частично возникающие из-за генетических отклонений, различные виды рака оказались на переднем плане в качестве потенциальных целей генной терапии CRISPR. В настоящее время рак толстой кишки является одной из наиболее тяжелых форм рака с одним из самых высоких показателей заболеваемости; по данным Американского общества рака (ACS), рак толстой кишки является третьей наиболее часто диагностируемой формой рака у мужчин и женщин в Соединенных Штатах. Только в 2018 году ACS прогнозирует 97 220 новых диагнозов и 50 630 смертей, связанных с этой формой рака, что явно побуждает исследователей рака уделять повышенное внимание попыткам лечения этого типа заболеваний.
Молекулярная основа для колоректального рака включает сбой в одном из многих (если не множественных) клеточных путей, включая путь Wnt / β-катенин, путь PI3K / AKT, путь Ras / Raf и путь NF-κB , Развитие колоректальной аденокарциномы происходит от мутаций в клетках, выстилающих желудочно-кишечный тракт (GI), поскольку эпителиальные клетки, которые наследуют мутации в определенных онкогенах и генах-супрессорах опухолей, подвержены постоянному пролиферативному состоянию. Следовательно, постоянный оборот и самообновление эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта приводит к карциноме (Rosa MD et al, 2015, Oncology Reports). Колоректальный рак имеет несколько известных генетических корней, которые, если его изменить, потенциально могут снизить вероятность его возникновения у пациентов; на рисунке # 2 перечислены различные известные ассоциированные гены, связанные с наследственным колоректальным раком. Некоторые из наиболее распространенных генетических мутаций, которые приводят к колоректальному раку, включают в себя гены MLH1 и MSH2, два из нескольких генов, ответственных за восстановление несоответствия ДНК (MMR) (Jass JR, 2006, World J Gastroenterol). Те, которые несут эту мутацию или другие мутации генов в пути MMR, имеют гораздо более высокий шанс развития наследственного неполипозного колоректального рака (HNPCC), также известного как синдром Линча. Синдром Линча является наиболее распространенным синдромом колоректального рака и, как таковой, приводит к приблизительно 80% пожизненному риску развития колоректального рака при наследовании (Wagner et al, 2003, American Journal of Human Genetics). Мутации генов MLH1 и MSH2 тесно связаны с синдромом Линча, поскольку мутации в одном или обоих генах обнаруживаются у 70-85% диагностированных (Dowty JG, 2013, Human Mutation).
В дополнение к синдрому Линча семейный аденоматозный полипоз (FAP) представляет собой отдельный, хорошо изученный наследственный колоректальный синдром с определенными генетическими предрасположениями, более конкретно аутосомно-доминантный тип наследования. FAP связан с мутацией зародышевой линии в гене аденоматозного полипоза (APC), расположенном на хромосоме 5q21 (Galiatsatos P, 2006, Американский журнал гастроэнтерологии). В этих случаях развитие колоректального рака можно проследить до модификации в двух отдельных типах генов: генах-супрессорах опухолей (TSG) и онкогенах. TSG в их немутантной форме ответственны за запрограммированную гибель клеток (апоптоз) путем активации путей, которые уменьшают уровни пролиферации клеток. С другой стороны, онкогены являются генами, которые вызывают рак (после активации из-за протоонкогенов) и обычно приводят к ускоренной пролиферации клеток и, в конечном итоге, к образованию опухолей (Baeissa H et al, 2017, Oncotarget). Развитие колоректального рака у этого специфического пути существа с мутацией в гене APC, который служит TSG. После инактивации посредством мутации ген APC не способен предотвращать пролиферацию клеток и, следовательно, отвечает за FAP, а также за 85% спорадического колоректального рака (Kinzler WK, 2014, Cell).
Современное состояние генной терапии:
По мере того, как проводилось больше исследований в области генной терапии, она постепенно стала жизнеспособным вариантом лечения различных заболеваний, включая рак. Сама генная терапия – это включение новых генов в геном пациента, который не способен производить жизнеспособные генные продукты из-за того, что у них отсутствуют или неактивны гены. Ученые обнаружили, что сконструированные вирусы, которые содержат желаемый генетический материал, являются одними из лучших носителей генной терапии, поскольку они эволюционировали для модификации геномов организмов с использованием их собственного генетического материала (Robbins PD, 1998, Pharmacology and Therapeutics). Более конкретно, аденовирусные и ретровирусные векторы использовались в качестве наиболее популярного выбора агента доставки; аденовирусы были включены в генную терапию из-за их способности трансдуцировать как в делящихся, так и в неделящихся клетках, тогда как ретровирусы используются для их способности интегрировать свой генетический материал непосредственно в геном (Relph K, 2004, BMJ: British Medical Journal). Недавно были разработаны невирусные методы переноса генов для расширения возможностей генной терапии; такие технологии, как катионная липосома и другие поликатионные технологии, оказались успешными (Keeler AM, 2017, Clinical and Translational Science).
Что касается технологии CRISPR, используемой в качестве нового метода генной терапии, то ее развитие связано с более ранними попытками редактирования генов. Подобно CRISPR, другие технологии редактирования генов используют сайт-специфические двухцепочечные разрывы ДНК для включения новой ДНК в геном; Эти технологии включают в себя мегануклеазы, нуклеазы цинковых пальцев (ZFN) и эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN) (Kim EJ, 2016, Korean J Intern Med). Система редактирования генов CRISPR-Cas9 превзошла другие технологии благодаря нескольким преимуществам, включая специфичность сайта; мегануклеазы не столь специфичны в распознавании ДНК, как другие системы, поскольку они нацелены на последовательности ДНК длиной 14-40 пар оснований (Silva G, 2011, Current Gene Therapy). Было показано, что ZFN и TALEN обладают большей специфичностью к сайтам, чем мегануклеазы, но страдают от других ограничений, которые делают CRISPR гораздо более выполнимым вариантом. Зависимость ZFN как от контекста, так и от состояния делает его неэффективной технологией для модификации генома (Bach C, 2014, Biotechnology Research International). Преимущества TALEN перед CRISPR заключаются в том, что они функционируют посредством прямого связывания между эффектором, подобным активатору транскрипции (TALE), и каждой парой оснований (Gaj T, 2013, Trends in Biotechnology). Однако использование TALEN ограничено из-за отсутствия практичности, так как для синтеза высококонсервативных и повторяющихся структур TALE требуются современные методы молекулярного клонирования (Joung JK, 2013, Nat Rev Mol Cell Biol).
Текущие исследования по редактированию генома для тех, у кого диагностирован рак, проводятся в трех отдельных областях: моделирование рака in vivo, обнаружение генов и исследование некодирующего генома. Что касается моделирования in vivo, технология CRISPR произвела революцию в использовании модельных организмов для дальнейших исследований, сводя к минимуму влияние определенных ограничений. Как правило, производство трансгенных организмов служит дорогостоящим и длительным процессом, когда осуществляется посредством гомологичной рекомбинации для выделения тех, кто обладает нужными генами (Li X et al, 2017, Hum Genet). CRISPR, однако, устраняет многие из этих проблем, поскольку он позволяет включать специфические мутации на ранних этапах развития организма и позволяет модифицировать соматические клетки взрослых (Wang H, 2015, Human Gene Therapy). Кроме того, возможность редактирования геномов с высокой специфичностью с использованием CRISPR позволяет повысить эффективность создания желаемых моделей рака, специфичных для изучаемого типа рака. Что касается открытия генов, было показано, что CRISPR и его возможности по редактированию генома имеют преимущества при нокауте генов. Разрушая отдельные гены, исследователи гораздо легче могут изучать функции генов на уровне генома (Shalem O, 2014, Science). Что касается исследования некодирующего генома, CRISPR продемонстрировал отличные функциональные возможности, так как те, кто изучал его, смогли применить эту технологию к подходам исследования генома с потерей функции и усилением функции. Было показано, что некодирующий геном оказывает большое влияние на уровни экспрессии генов, и использование CRISPR для модификации этой части генома позволило изучить конкретные гены в попытке оценить их роль в генетически связанных расстройствах, таких как различные виды рака (Canver MC, 2017, Methods).
Клинические испытания, в том числе внедрение технологии CRISPR, были относительно новыми, так как первое официальное испытание такого рода началось в октябре 2016 года. С тех пор было проведено несколько клинических испытаний с использованием CRISPR в качестве варианта лечения различных злокачественных заболеваний, начиная с от новообразований до ВИЧ-инфекции; На рисунке № 3 показаны различные текущие клинические испытания по состоянию на февраль 2018 года (Xu et al, 2018, Front. Cell Dev. Biol.).
Потенциал CRISPR при колоректальном раке:
Поскольку исследователи знают о нескольких ключевых генетических связях с несколькими видами рака, включая колоректальный рак, целью многих является использование CRISPR-Cas9 в качестве «важного канала между скамейкой и местом у кровати» онкологических больных (Sanchez-Rivera FJ, 2015, Nat. Rev. Cancer). Чтобы лучше изучить гены, которые были связаны с развитием колоректального рака, исследователи разработали эксперименты in vivo, которые в основном используют генно-инженерных мышей в качестве основного модельного организма. CRISPR в этих экспериментах в основном используется в качестве основной детерминанты типов мутаций, которые оцениваются, чтобы превратить клетки в ростовые преимущества при развитии мультиклональной опухоли (Ratan ZA et al, 2018, Ther. Adv. Med. Oncol.). В одном конкретном исследовании исследователи использовали технологию редактирования генома для изменения генома соматических клеток мыши дикого типа для оценки роли определенных генов в онкогенезе. Более конкретно, редактирование CRISPR-Cas9 было реализовано через лентивирусные векторы для разрушения генов-супрессоров опухолей APC и Trp53 в эпителиальных клетках толстой кишки и, таким образом, индуцирования образования автохтонных опухолей (Roper J et al, 2017, Nat. Biotechnol.).
В отдельном исследовании оценивалась роль различных генов в путях, о которых известно, что они связаны с образованием колоректальной опухоли человека (перечислены выше). CRISPR-Cas9 использовали для индукции мутаций в органоидах, выделенных из кишечного эпителия человека; гены-супрессоры опухолей APC, SMAD4 и Tp53, а также онкогены KRAS и PIK3CA были созданы в этих клетках и имплантированы мышам. Результаты показали, что органоиды, которые экспрессировали мутации во всех генах-мишенях, росли независимо от нишевых факторов in vitro, что приводило к развитию опухоли под почечной субкапсулой у мышей. Принимая во внимание и другие паттерны развития опухоли, результаты показали, что «мутации пути« водителя »позволяют поддерживать стволовые клетки в микроокружении враждебной опухоли, но что для инвазивного поведения необходимы дополнительные молекулярные повреждения» (Matano M, 2015, Nat. Med. ). Получив такие результаты, исследователи в конечном итоге смогли смоделировать колоректальный рак …
Генитальный туберкулез – причина бесплодия среди женщин Вполне вероятно, что у каждого из нас был член семьи или знакомый, пострадавший от туберкулеза. Туберкулез является серьезной
Несмотря на то, что в клинических условиях много раз наблюдали преимущества эффекта плацебо у пациентов, внимательно изучая пациентов, проходящих лечение от болезни Паркинсона, лечения боли
Доставка кесарева сечения также называется доставкой кесарева сечения. Этот способ включает развертывание операции по доставке детей, то есть одного или нескольких. Роды кесарева сечения часто