Более 90% смертности от рака вызвано метастазированием. Для разработки новых терапевтических стратегий жизненно важно понимать возникновение и прогрессирование метастазирования. Для выявления и локализации метастазирования опухолевых клеток ученые разработали массив на основе флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Существует два типа клеток метастазирования: клетки метастазирования из клеток с низкой нагрузкой и клетки метастазирования из клеток с высокой нагрузкой. После трансплантации метастазирующие клетки с низкой нагрузкой показали, что они обладают значительным количеством способности инициировать опухоль и могут дифференцироваться, чтобы продуцировать подобные люминалу раковые клетки. Когда метастатические клетки с низкой нагрузкой прогрессируют в метастазирующие клетки с высокой нагрузкой, они получают повышенную пролиферацию и экспрессию MYC. Это может быть ослаблено с использованием ингибиторов. Все это поддерживает иерархическую модель, в которой метастазирование инициируется стволовыми клетками, и может прогрессировать от метастазирующих клеток с низкой нагрузкой к высоким. Человеческая грудь содержит два вида эпителиальных линий: базальную / миоэпителиальную, которая содержит стволовые клетки, и просветную линию, которая содержит клетки-предшественники и зрелые клетки.
Ученые использовали ткани молочной железы от маммопластики трех человек. Используя многочисленные статистические анализы, они пришли к выводу, что базальная / миоэпителиальная и просветная линия различна для всех. В этом эксперименте они сосредоточились на конкретном подтипе, потому что этот подтип является наиболее агрессивным и подходящего лечения для него не существует. Полученный от пациента ксенотрансплантат сохранял те же свойства у мышей, что и у пациентов, и поэтому он был пригоден для исследований метастазирования человека. Чтобы изолировать метастазирующие клетки от мышей, полученных от ксенотрансплантата, они разработали новый массив на основе FACS. При этом им удалось обнаружить метастатические клетки в 70% полученных от пациента ксенотрансплантатов периферической ткани от мышей. Мышей анализировали, когда их опухоли достигали 20-25 мм в диаметре. Кинетика роста была последовательной в каждой модели. Хотя опухоль каждого животного имела примерно одинаковый диаметр, у всех были большие различия в метастатической нагрузке.
Ученые также обнаружили, что графики PCA для мышей с метастазирующими клетками с низкой нагрузкой были дальше от опухоли, из которой они получены, чем с метастазирующими клетками с высокой нагрузкой. Другие эксперименты также показали, что метастазирующие клетки с низкой нагрузкой любят образовывать кластеры друг с другом, тогда как метастазирующие клетки с высокой нагрузкой любят образовывать кластеры с первичными опухолевыми клетками. Ученые обнаружили, что метастазы с низкой нагрузкой сохраняют свои базальные / миоэпителиальные признаки. У них были более высокие уровни 22 базальных / миоэпителиальных генов и более низкие уровни 7 люминальных генов. Сосредоточившись на кластеризации только метастазирующих клеток, ученые обнаружили невероятную неоднородность в дифференцировке, которая коррелировала с метастатической нагрузкой. Сродни метастатическим клеткам молочной железы, организованным в два разных кластера, где клетки с низкой нагрузкой были наиболее базальными / стволовыми, а клетки с высокой нагрузкой – наиболее люминальными. Ученые пришли к такому же выводу с метастатическими клетками легких. Это означает, что это явление является консервативным в каждой модели. Существовали некоторые различия между экспрессией генов метастатических клеток легкого в разных моделях, но их было недостаточно для кластеризации метастатических клеток по отдельности с помощью моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациентов.
Чтобы исследовать гетерогенность на уровне белка, ученые провели иммуноокрашивание для базального и люминального генов. Опухолевые клетки, обнаруженные в микрометастазе из тканей с низким бременем, имели высокий процент для базального гена и люминального гена, а ткани из тканей с высоким бременем имели высокий процент для люминального гена и были гетерогенными для базального гена. Это говорит о том, что статус дифференцировки коррелирует с метастатической нагрузкой на уровне белка. Посредством анализа отдельных клеток ученые обнаружили, что в метастатических клетках с низкой нагрузкой были высокие уровни генов плюрипотентности. Эти гены предполагают, что они используются эмбриональными программами для самообновления и поддержания. Метастатические клетки с низкой нагрузкой также экспрессировали более высокие уровни типичных EMT-маркеров, за исключением EMT-маркера, который обычно был обнаружен в нормальных базальных / стволовых клетках. Все эти данные согласуются с предыдущими сообщениями, которые показывают, что EMT способствует стемозу в молочной железе, и предполагают, что метастатические клетки с низкой нагрузкой используют программу EMT, чтобы облегчить распространение.
Дальнейшие исследования также показали, что гены, вовлеченные в реакцию повреждения ДНК, модификацию хроматина, дифференцировку, апоптоз и клеточный цикл, были дифференцированно экспрессированы в метастатических клетках с низкой нагрузкой. Из-за гетерогенности в метастатических клетках ученый задавался вопросом, являются ли стволовые клетки похожими на клетки? непосредственно приводят к образованию люминальных клеток, или если люминальные клетки происходят из клеток-основателей. После эксперимента ученый пришел к выводу, что подобные люминалу клетки могут происходить из клеток, которые распространяются на ранних стадиях роста первичной опухоли. Чтобы проверить рост и дифференцировку метастатических клеток, подобных стволовым, ученые трансплантировали метастатические клетки с низкой нагрузкой в молочные железы. Интересно, что 2 из 4 трансплантированных клеток вызывали большие опухоли, тогда как первичные опухолевые клетки никогда не вызывали опухолей, даже при 100-кратном большом количестве. Это согласуется с предыдущими сообщениями, которые показали, что опухоли PDX более эффективно увеличиваются как фрагменты, чем диссоциированные клетки.
После анализа отдельных клеток ученые пришли к выводу, что метастатические клетки с низкой нагрузкой обладают высокой способностью инициировать опухоль и что они могут вызывать образование люминальных опухолевых клеток. Это подтверждает гипотезу о том, что метастатические клетки, подобные стволам, вызывают образование метастатических клеток в просвете. Другой интересный вопрос, который был задан учеными, заключается в том, присутствуют ли стволовые клетки в опухолевых клетках или развиваются ли они после взаимодействия с их микроокружением. После испытания ученые пришли к выводу, что первичные опухоли содержат редкую субпопуляцию стволовых клеток, и что процент коррелирует с метастатическим потенциалом. Впоследствии ученые хотели узнать, может ли обогащение этой подобной стволу сигнатуры в первичных опухолях быть предиктором отдаленного метастазирования в наборах данных пациентов. После анализа ученые обнаружили, что 16 из 55 генов, связанных со стволовыми метастатическими клетками, были значительно прогностическими. Предыдущая работа показала, что метастатические клетки в разных органах демонстрируют специфические признаки экспрессии генов. Контролируемая кластеризация целевым органом показала, что метастатические клетки в мозге, костном мозге и периферической крови имеют различия в паттернах экспрессии генов. Метастатические клетки головного мозга самые разные.
КТК очень важны для диагностики. Большинство CTCs и DTCs костного мозга сгруппированы с промежуточными метастатическими клетками. Это могло быть потому, что клетки были от животных с промежуточным бременем. Тем не менее, 16,7% и 10,7% показали более базальную / подобную стволу сигнатуру, что предполагает, что эти подобные стволу клетки могут представлять собой исходные метастатические клетки сеялки. Ученые также наблюдали сдвиг в сторону более быстрого увеличения сигнатуры, которая была коррелирована с увеличенная метастатическая нагрузка. Метастатические клетки с низкой нагрузкой экспрессировали более высокие уровни генов, связанных с покоем и покоем. Метастатические клетки с более высокой нагрузкой, по-видимому, входят в клеточный цикл, экспрессируя более низкие уровни генов, связанных с покоем и покоем, и более высокие уровни генов, способствующих клеточному циклу. Ученые также обнаружили первичные опухолевые клетки (22,2%) с этой менее пролиферативной сигнатурой.
Эти открытия вдохновили ученых проверить, может ли блокирование этого перехода из неактивности в клеточный цикл остановить прогрессирование метастазирования. Поскольку ученые обнаружили высокий уровень как MYC, так и CDK2 в метастатических клетках на более поздней стадии, ученые решили протестировать ингибитор CDK, который, как было показано, прекращает апоптоз в раковых клетках с высокой экспрессией MYC. Ученые выдвинули гипотезу, что апоптоз начнется в метастатических клетках, прогрессирующих в пролиферацию, так как они, по-видимому, активируют MYC. После тестирования этого на мышах ученые обнаружили, что, глядя в высоком разрешении на экспрессию генов в единичных метастатических клетках, ученые обнаружили ранее неосуществленный диапазон дифференцировки и экспрессии генов, связанный с метастатической стадией, и продемонстрировали, что этот подход может облегчить распознавание новые потенциальные лекарственные средства с эффективностью против метастатической болезни. МЕТОДИЧЕСКОЕ ИЗДЕЛИЕ Для начала анализа исследователи сначала собрали клеточные линии и ксенотрансплантаты опухолевых тканей, которые были выращены и получены в соответствии со стандартными и этическими протоколами.
Ксенотрансплантаты были разделены на фрагменты опухоли и размножены в груди мышей. Когда опухоли стали ощутимыми, именно тогда опухоли измеряли еженедельно, чтобы контролировать скорость их роста. Фрагменты опухоли хранили, замораживая их в жидком азоте. Все животные, от которых были получены ксенотрансплантаты, были умерщвлены в конце, когда опухоли выросли до размера примерно от 20 до 25 мм. Во время эксперимента по резекции опухоли обычно удалялись, когда они достигали размера примерно от 10 до 12 мм. Животные, у которых была выполнена резекция, были возвращены в свою колонию и имели право выращивать метастазы в течение 8 недель, в течение которых легочная ткань собиралась и анализировалась с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) для клеток человека. Для измерения функциональных активность метастатических клеток, эксперименты с ортотопической трансплантацией проводили на животных. Конкретные метастатические клетки в лимфатических узлах, а также определенные опухолевые клетки из сопоставимых животных были отделены с помощью FACS и объединены от различных животных. Сортированные клетки были сформированы в гранулы и вставлены в среду. Разбавленные версии были введены в грудь мышей 3,5-недельного возраста, а трансплантаты были взяты через 4,5 месяца, когда первичные опухоли стали размером 20 мм.
После этого начались эксперименты по лечению динациклиба, которые проводились, когда опухоли становились ощутимыми. Dinaciclib был загрунтован и приобретен в соответствии с протоколом. Мыши были случайным образом назначены для лечения, когда опухолевые клетки были трансплантированы и проанализированы с помощью слепой конструкции. В общей сложности 49 животным вводили лечение три раза в неделю. Животных измеряли два раза в неделю, чтобы сообщить о росте первичной опухоли. Мышей умерщвляли в конце лечения или раньше, если опухоль достигала 20 мм в диаметре. Животные, у которых развился неблагоприятный эффект, были исключены из исследования. Значения экспрессии гена микроматрицы рассчитывали с использованием некоторой формы статистической программы. Гены плазматической мембраны в значительной степени экспрессируются на всех 15 ксенотрансплантатах образца опухоли. 12 исходных образцов опухоли пациентов были ранжированы от самой высокой до самой низкой экспрессии. Предсказанное значение каждой из 55 характеристик генов метастатических клеток с низкой нагрузкой было разработано с помощью анализа Каплана-Мейера.
Все твердые ткани и мозг были диссоциированы на FACS. Ткани разрезали и помещали в культуральную среду. Затем их разрушали в течение 45 мин при 37 ° С. Возникшие суспензии затем вставляли в раствор ДНКазы на 3 минуты при комнатной температуре, после чего их снова промывали и диссоциировали. После сбора периферической крови, супернатанта и костного мозга клетки осаждали в течение 5 минут и оставшиеся эритроциты в периферической крови, легких и опухолевых образцах лизировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Все неиспользованные образцы были непосредственно отфильтрованы и сохранены путем замораживания их в жидком азоте. Ткани от восстановительной маммопластики промывали три-пять раз, разрезали на мелкие фрагменты и переваривали в течение ночи в растворе. Затем расщепленные фрагменты гранулировали в течение 3 минут, замораживали и затем хранили в жидком азоте. Антитела к нескольким конкретным человеческим антигенам были куплены коммерчески. Антитела как человека, так и мыши окрашивали. После 15 минут нахождения на льду окрашенные клетки промывали, чтобы избавиться от избытка антител, и помещали обратно в среду. Затем клетки сортировали и анализировали в потоке. Мертвые клетки удаляли, а загрязняющие гематопоэтические и эндотелиальные клетки человека или мыши исключали. Полный образец ткани в экспериментах с одноклеточным мультиплексным КПЦР пропускали через проточный цитометр. В тканях всех животных обнаружено устойчивое количество живых клеток.
Результаты исследования мышей с отклонениями более чем на одно стандартное отклонение были исключены из исследования. Эксперименты по экспрессии гена в одной клетке проводили на микрожидкостных чипах. Отдельные клетки сортировали с использованием FACS в отличительные лунки. Эксперименты проводились в соответствии с протоколом. Каждая лунка была предварительно заполнена раствором. После процесса сортировки покрытые ПЦР клетки замораживали и / или помещали в термоциклер для прохождения процесса комбинированной обратной транскрипции и специфичной для мишени амплификации. Реакционный раствор экзонуклеазы впоследствии добавляли для удаления неинкорпорированных праймеров. Каждую лунку затем разбавляли. Бит из каждого образца затем помещали в отдельную чашку и смешивали с другим раствором. Индивидуальные смеси для анализа праймеров были приготовлены в еще одной чашке. Чипы были загрунтованы до того, как образцы и образцы были смешаны с ними. Затем чипсы были тщательно оценены. Все данные одноклеточной ПЦР были проанализированы с использованием программного обеспечения для статистического анализа. В целом, 268 клеток молочной железы от сокращения маммопластики, а также 441 метастатического и 523 первичных …
Мужчины очень долго правили в индустрии фитнеса. Не удивительно, что женщины в равной конкуренции соревнуются с мужчинами в индустрии фитнеса. Они также ищут идеальное тело,
Генитальный туберкулез – причина бесплодия среди женщин Вполне вероятно, что у каждого из нас был член семьи или знакомый, пострадавший от туберкулеза. Туберкулез является серьезной
Есть несколько разных циклов, вокруг которых вращается Земля. Некоторые из циклов были затронуты катастрофой Фукусима-Дайхатсу. Завод в Фукусиме пострадал от землетрясения силой 9,0 балла. Растения,