Сочинение на тему Сравнение методов выделения EV для обнаружения микроРНК

Более подробное сравнение было проведено некоторыми другими группами. Андреу и соавт. тестирование осаждения на основе ПЭГ другими методами, основанными на ультрацентрифугировании, колонках или системах фильтрации. Они пришли к выводу, что общая эффективность ПЭГ была очень похожа или лучше, чем у других коммерческих осаждающих реагентов, по выходу как белка, так и микроРНК. Однако Lobb et al. сравнили аналогичные методы и обнаружили, что современные протоколы преципитации для выделения ЭВ из кондиционированной среды и плазмы клеточной культуры дают наименее чистые препараты ЭВ. По мнению авторов, изоляция по размеру дает результаты, аналогичные очистке с помощью градиента плотности EV с высокой чистотой частиц. Они предлагают комбинировать ультрафильтрацию с SEC, чтобы выделить высокоочищенные ЭМ из среды для культивирования клеток и человеческой плазмы в эффективные временные рамки. Tang et al. сравнивались не только разные методы выделения, но и различные наборы для экстракции РНК. Их результаты также продемонстрировали, что методы осаждения (ExoQuick и TEI) приводят к более высокой эффективности изоляции, чем традиционные UC, но также имеют более высокую контаминацию белка. Больше общих РНК было выделено методами осаждения, но чип РНК показывает, что часть этого может происходить из-за контаминации белка. Дальнейшие анализы секвенирования РНК доказали, что метод выделения может влиять на небольшой профиль РНК. В последнее время Бушман и его коллеги используют NGS для сравнения различных методов выделения EV и выделения РНК. Их результаты показывают, что каждый метод генерирует систематическую ошибку в субпопуляциях EV, а также в загрязнениях. В то время как методы осаждения и сродства к мембране дают самые высокие показатели чтения микроРНК, методы на основе SEC обеспечивают изоляты EV с максимальной чистотой.

Методы выделения РНК также сравнивали Eldh et al.. Все методы оценивали выделенную высококачественную и чистую РНК по оценке числа целостности РНК (RIN) и значений OD. Подход связывания столбцов привел к наивысшему выходу РНК и широчайшему распределению по размеру РНК, тогда как методы на основе фенола обогащают небольшие РНК, включая миРНК, но имеют более низкое восстановление и более узкое распределение по размеру РНК.

Помимо сред для культивирования клеток и плазмы, эффективность выделения ЭМ из образцов мочи оценивалась различными группами. Wachalska et al. продемонстрировали, что SEC может отделять EV от фракции белкового комплекса (THP-protein-network), тогда как другие два коммерческих набора не могли. Эти наборы, основанные на преципитации, приводили к более низкому восстановлению miRNA из теста RT-qPCR трех miRNAs (miR-375, miR-204 и miR-21). Они также обнаружили, что эти три микроРНК имеют различное соотношение во фракции EV и фракции белка, что доказывает важность чистоты EV. Ройо и соавт. сравнили пять различных методов, основанных на ультрацентрифугировании, осаждении и связывании лектина. Результаты профилирования miRNA массивом miRNA показывают высокую корреляцию между всеми протестированными методами и наборами. Channavajjhala et al. показали, что ультрафильтрация в сочетании с колонками exoRNA SeraMir представляет собой оптимальную процедуру очистки miRNA от мочевых EV. Более того, условия хранения мочи, такие как замораживание, не влияют на относительное количество экзосомальных микроРНК мочи.

Принимая все эти результаты вместе, большинство исследователей сходятся во мнении, что метод SEC дает более чистые EV, чем осадки и ультрацентрифугирование. Основываясь на недавних результатах и ​​разработках в области выделения EV и характеристики РНК, мы обеспечиваем полный рабочий процесс для анализа груза EV miRNA из образцов плазмы, который можно легко адаптировать к другим типам биологических жидкостей или видам РНК и ДНК.