Род Xanthomonas включает важную группу грамотрицательных растений, патогенных бактерий, которые заражают приблизительно 350 различных растений и вызывают большие экономические потери во всем мире [1, 2]. Один представитель этого рода, Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Xoo) является важным возбудителем риса. Это сосудистый патоген, проникающий в растение через гидатоды, вызывающий бактериальный гниль риса [3]. Симптомы наблюдаются на стадии кущения, заболеваемость увеличивается с ростом растений, достигает пика на стадии цветения. Kresek является более разрушительным проявлением болезни, когда листья всего растения становятся бледно-желтыми и увядают во время рассады до ранней стадии кущения, что приводит к частичному или полному неурожаю [4]. Известно, что заболевание встречается в масштабах эпидемии во многих частях мира, что приводит к серьезной потере урожая до 50%. Серьезность и значимость ущерба, вызванного инфекцией, обусловили необходимость разработки стратегий борьбы с болезнью и борьбы с ней, с тем чтобы уменьшить потери урожая и предотвратить эпидемию. Грамотрицательные патогенные бактерии сильно зависят от секретарных систем вирулентности [5]. Секретарный путь в системах патогенов растений часто приводит к потере патогенеза или серьезному снижению вирулентности [6]. Диффузионный сигнальный фактор (DSF) – это длинноцепочечная жирная кислота, а химическое название – «цис-11-метил-2-додеценоевая кислота».
Механизм DSF-зависимого определения кворума (QS) в Xoo позволяет определять плотность населения и синхронизировать индивидуальную активность с поведением сообщества. По-видимому, это обеспечивает бактериальным патогенам очевидное конкурентное преимущество перед их хозяевами во взаимодействии патоген-хозяин [7]. Сигналы семейства DSF были зарегистрированы в ряде растительных и человеческих бактериальных патогенов, включая Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Xoo), Xanthomonas campestris pv. Campestris (Xcc), Xyllela fastidiosa, Stenotrophomonas maltophilia и Burkholderia cenocepacia. Система передачи сигналов DSF включает несколько ключевых регуляторных белков и второй мессенджер циклический-ди-GMP (c-di-GMP). Среди них двухкомпонентная система RpfC / RpfG участвует в зондировании и передаче сигнала DSF с помощью консервативного механизма фосфорилирования в Xoo. Предполагаемая еноил-КоА-гидратаза RpfF является ключевым ферментом для биосинтеза DSF. Функциональный анализ мутантов RpfF или RpfC у разных видов бактерий позволяет предположить, что общая роль DSF-сигнальной системы в модуляции вирулентности, по-видимому, сохраняется, но регуляторные механизмы и DSF-зависимые признаки могут различаться среди таксонов [8]. Поскольку система QS DSF участвует в вирулентности по отношению к растению риса, блокирующая DSF синтаза RpfF может быть возможным целевым белком для контроля инфекции. В обзоре исследования выясняется, что трехмерная структура (3D) белка DSF синтазы RpfF из Xanthomonas oryzae pv. oryzae остается неизвестным.
В свете вышесказанного, настоящее исследование было направлено на прогнозирование трехмерной структуры белка RpfF и выявление сильных ингибиторов с помощью вычислительных методов.
Материалы и методы
Поиск последовательности
Последовательность белка DSp синтазы RpfF (инвентарный номер: AAL06345; длина: 289 остатков), из Xanthomonas oryzae pv. oryzae был получен из NCBI Entrez. На этапе моделирования гомологии мы хотели бы найти подходящие шаблоны для моделирования последовательностей белка RpfF, выровненных со структурами в банке данных белка с использованием инструмента NCBI-BLASTp [9], который доступен на веб-сайте NCBI с использованием порога по умолчанию E-значение 6 и пороговое значение включения 0,005.
Конструирование белка RpfF путем моделирования гомологии:
3D-модель белка RpfF была построена на основе шаблона с использованием MODELLER 9v11 [10]. Кристаллическая структура 3M6M была выбрана в качестве шаблона для моделирования белка RpfF. Последовательности белка RpfF и 3M6M с использованием ClustalX с весовая матрица Гонне (штраф за открытие промежутка 10 и штраф за расширение промежутка 0.2) [11]. Выравнивание между белком RpfF и 3M6M использовалось для построения модели в моделировщике 9v11 [12]. Для моделирования белка RpfF был смоделирован из белка 3M6M. Полученный белок RpfF был уточнен по протоколу медленной и большой оптимизации от Modeller и PROCHECK [13]. Диаграмма графика Рамачандрана была дополнительно уточнена путем минимизации энергии.
Оценка модели гомологии:
Качество геометрии белка проверялось с помощью PROCHECK [13], verify_3D, используемого с его веб-сервера. PROCHECK применяется для определения комбинаций f и? Углы остатков в доступных зонах графика Рамачандрана, в то время как verify-3D использует функцию оценки для оценки качества модели. Также значения RMSD между наложенной моделью и кристаллографической структурой были рассчитаны с использованием наложенной программы. Молекулярный просмотрщик PyMol был использован для анализа пристыкованных структур.
Идентификация активного сайта
Активный сайт белка RpfF был идентифицирован с использованием сервера CASTp (компьютерный атлас поверхностной топологии белка). Новая программа CASTp для автоматического определения местоположения и измерения карманов и полостей белка основана на точных методах вычислительной геометрии, включая альфа-форму и теорию дискретного потока. Идентификация CASTp и измерение доступных для поверхности карманов, а также внутренних недоступных полостей путем определения местоположения, разграничения и измерения вогнутых областей поверхности на трехмерной структуре белков. Измерение включает в себя площадь и объем кармана или пустоты по модели поверхности, доступной для растворителя (поверхность Ричардса), и по модели молекулярной поверхности (поверхность Коннолли), рассчитанной аналитически. Он также может быть использован для изучения особенностей поверхности и функциональных областей белка. 2.5 Скрининг лигандов: коммерчески доступные лиганды перечислены в общедоступных базах данных, таких как база данных Zinc, которая содержит более миллиона соединений, готовых к стыковке, и предоставляет 3D-форматы. Виртуальный скрининг появился как дополнительный подход к скринингу с высокой пропускной способностью и стал важным методом in silico в фармацевтической промышленности [15]. Виртуальный скрининг на основе структуры начинается с идентификации потенциальных сайтов связывания лиганда на целевых белках. Обычно молекулы, которые соответствуют критериям биологической активности, соответствуют характеристикам, содержащимся в правиле Липински о пяти [16].
В настоящей работе мы выбрали 1500 закрепленных лигандов на основе сходства структуры с запросом природного соединения рифампицина. AutoDock Vina в PyRx Virtual Screening Tool использовался для скрининга выбранных лигандов из базы данных Zinc и минимизации энергии.
Молекулярные стыковки
Стыковка – это вычислительный метод, который предсказывает предпочтительную ориентацию одной молекулы ко второй, когда они связаны друг с другом, образуя стабильный комплекс. Стыковка широко использовалась, чтобы предложить способы связывания белковых ингибиторов. Большинство алгоритмов стыковки способны генерировать большое количество возможных структур, поэтому им также требуются средства для оценки каждой структуры, чтобы идентифицировать те, которые представляют наибольший интерес. Стыковка осуществлялась с использованием AutoDock Vina в инструменте PyRx Virtual Screening [18].
Молекулы лекарств из цинковой базы данных были пристыкованы к уточненной модели. Ламаркский генетический алгоритм (Solis et al., 1981) использовался как число отдельных популяций (150), максимальное количество энергетических оценок (2500), максимальное число поколений, частота мутаций гена (0,02), частота кроссовера (0,8), бета Коши (1,0) и размер окна GA (10,0). Сетка была установлена для целого белка из-за мультисвязывающего кармана при X = 3,42, Y = -56,23, Z = 98,32 и размере AO) при X = 89,92, Y = 98,56, Z = 98,32 и полнота 8. Поза для данного лиганда идентифицируется на основе самой высокой энергии связи. Молекулярный просмотрщик PyMol был использован для анализа пристыкованных структур.
Результаты и обсуждение
Выбор шаблона
Последовательность, имитирующая поиск белка RpfF против PDB с использованием программы NCBI-BLASTp, показала, что белок RpfF действительно демонстрирует высокое сходство последовательностей с известной структурой белка 3M6M. Было обнаружено, что единственным попаданием из 3M6M была кристаллическая структура запроса, которая показала сходство последовательностей с белком RpfF (идентификаторы последовательности: 87%, значение E: 1,23, положительные значения: разрывы 93%: 1% и охват запроса: 91%). , Следовательно, 3M6M использовали в качестве матрицы для моделирования белка RpfF.
Гомологическое моделирование RpfF:
Белок RpfF моделировали с использованием моделирования гомологии с помощью программы MODELLER 9v11 и структуры 3M6M в качестве матрицы. Координаты структурно-консервативных областей (SCR), структурно-вариабельных областей (SVR), N-концов и C-концов из шаблона были назначены целевым последовательностям на основе удовлетворения пространственных ограничений. Все боковые цепи модельного белка были установлены ротамерами. Сотни моделей были созданы с использованием MODELLER 9v11. Наименьшая структура оценки DOPE была выбрана для структурной оценки.
Построение и проверка 3D-модели
Стереохимическое качество модели было выяснено компанией ПРОЧЕК Север. График Рамачандрана показал, что 92,4% остатков были нанесены в пределах наиболее предпочтительной области, 6,6% остатков были расположены в пределах дополнительно разрешенной области, 1,0% остатков в обычно разрешенной области и 0,0% остатков в запрещенной области. Путем адаптации программы Whatcheck вычисленные значения Z-показателя для длин связей-0,941, расстояний связей-0,019, угла скрепления-1,203, ограничений по углу омега-0,735, неправильного двугранного распределения-0,856, внутреннего / наружного распределения-1,059, двугранного RMS Z- балл-0,856 были найдены соответственно. Таким образом, эти значения z-показателя являются положительными, чем в среднем. Общий коэффициент качества 75,466% наблюдался при использовании экологического профиля ERRAT. Varify_3D показал, что 90,66% всех остатков имели средний балл 3D-1D, превышающий 2, что указывает на высокую надежность модели. Построенная 3D-модель была наложена на шаблон с использованием программного обеспечения SPDBV. Среднеквадратичное отклонение структуры модели составило 0,45 Å, что указывает на надежность хорошей модели.
Лиганды скрининга:
Виртуальный скрининг – это эффективный подход для обнаружения ингибиторов с помощью новых химических каркасов. Двумерная структура рифампицина была использована в качестве запроса для поиска аналогичных соединений в базе данных цинка. Затем было проведено скрининг приблизительно 1500 соединений, и все соединения были сохранены для дальнейшей молекулярной стыковки. Попытки скрининга Rifampicin-подобных соединений, которые являются цитотоксичными в высоких дозах, дали несколько соединений, сохраняющих активность против обоих ферментов-мишеней.
Исследования стыковки:
Обработка белка RpfF включала минимизацию энергии и моделирование молекулярной динамики. Уточнение структуры белка было использовано для дока. AutoDock Vina использовался для док-исследований. Пристыкованная конформация, соответствующая самой низкой энергии связи, была выбрана в качестве наиболее вероятной конформации связи. Всего отобранные 1500 соединений были прикреплены к активному сайту белка RpfF. Энергии стыковки всех соединений представлены в ккал / моль.
Целью настоящего исследования было изучение новых ингибиторов и изучение роли связывающих полостей белка RpfF при болезни гниения риса с помощью структурных исследований на основе виртуального скрининга и молекулярного докинга. Затем уточнение структуры белка путем минимизации энергии улучшило общую структуру белка. Среди оцененных молекул, прошедших скрининг, десять соединений, таких как Zinc77312918, Zinc85907483, Zinc95100869, Zinc94303248, Zinc94313220, Zinc95100871, Zinc94313219, Zinc95100870, Zinc85907488 и Zinc94303231, оказались относительно более активными и сравнимыми с активностью. Этот класс химикатов был разработан в попытке уменьшить токсичность. Все соединения, которые мы обнаружили в этой работе, связываются с их соответствующими сайтами связывания, создавая водородные связи и гидрофобные взаимодействия с важными остатками в карманах связывания. Мы провели подробный анализ атомных взаимодействий между каждым потенциальным соединением и остатками внутри сайта связывания, чтобы определить, какие остатки взаимодействуют с соединениями. В заключение, настоящие результаты указывают на то, что эти соединения свинца являются основными ингибиторами белка RpfF при болезни гнили риса.
Мужчины очень долго правили в индустрии фитнеса. Не удивительно, что женщины в равной конкуренции соревнуются с мужчинами в индустрии фитнеса. Они также ищут идеальное тело,
Есть несколько разных циклов, вокруг которых вращается Земля. Некоторые из циклов были затронуты катастрофой Фукусима-Дайхатсу. Завод в Фукусиме пострадал от землетрясения силой 9,0 балла. Растения,
Этот эксперимент проводится для наблюдения за развитием эмбрионов перепелов в течение нескольких дней. Эмбрион перепела обычно развивается и выводится через 20-21 день. Мы провели эксперимент