Сочинение на тему Процедура Лоури

Наиболее точным методом определения концентрации белка является, вероятно, кислотный гидролиз с последующим аминокислотным анализом. Большинство других методов чувствительны к аминокислотному составу белка, и абсолютные концентрации не могут быть получены (1). Процедура Лоури и соавт. (2) не является исключением, но его чувствительность умеренно постоянна от белка к белку, и он настолько широко используется, что оценки белка Лоури являются вполне приемлемой альтернативой строгому абсолютному определению почти во всех обстоятельствах, в которых белковые смеси или сырые экстракты участвуют.

Этот метод основан как на реакции Биурета, в которой пептидные связи белков взаимодействуют с медью в щелочных условиях с образованием Cu +, которая реагирует с реагентом Фолина, так и на реакции Фолина-Чокальто, которая плохо изучена, но в эссенциальный фосфомолибдотунгсульфат восстанавливают до гетерополимолибденового синего путем катализируемого медью окисления ароматических аминокислот. Реакция приводит к сильному синему цвету, который частично зависит от содержания тирозина и триптофана. Этот метод чувствителен до примерно 0,01 мг белка / мл и лучше всего его использовать для растворов с концентрациями в диапазоне 0,01–1,0 мг / мл белка.

Почвенные экстракты обычно содержат большие количества растворенного гумифицированного органического материала, что обычно отражается в высоком содержании полифенолов. Поскольку полифенолы серьезно мешают количественной оценке экстрагированного белка, минимизация этого влияния важна для обеспечения репрезентативности измерений. Хотя колориметрический анализ Брэдфорда обычно используется в почвоведении для быстрой количественной оценки белка в почвенных экстрактах, он имеет несколько ограничений. Поэтому мы исследовали альтернативную колориметрическую методику, основанную на анализе Лоури (часто используемом для измерения белка и гуминовых веществ как отдельных пулов в микробных биопленках). Точность анализа Брэдфорда и модифицированного метода микропланшетов Лоури сравнивали в факториальной комбинации. Белок определяли количественно в почвенных экстрактах (экстрагированных цитратом), включая стандартные добавки модельного белка (BSA) и полифенола (Sigma H1675-2). Используя описанный анализ на микропланшетах Лоури, не было обнаружено никаких влияний цитрата, даже при концентрациях, в 5 раз превышающих те, которые обычно используются для экстракции почвенного белка.

Кроме того, было обнаружено, что анализ Брэдфорда очень чувствителен к двум одновременным и смешанным артефактам: 1) развитие цвета из-за добавленного белка было сильно ингибировано концентрацией полифенолов, и 2) существенное развитие цвета было вызвано непосредственно добавлением полифенолов. , В отличие от этого, метод Лоури позволил провести различие между развитием цвета от белкового и небелкового происхождения, обеспечивая более точный количественный анализ. Эти результаты позволяют предположить, что модифицированный метод Лоури является более подходящей мерой экстрактного белка (определяемого стандартными эквивалентами), потому что он меньше смешивается с высоким содержанием полифенолов, которое так типично для почвенных экстрактов. Анализ Лоури (1951) является часто цитируемым анализом белка общего применения. Некоторое время это был метод выбора для точного определения белка для клеточных фракций, хроматографических фракций, ферментных препаратов и так далее. Анализ бицинхониновой кислоты (BCA) основан на том же принципе и может быть выполнен за один этап, поэтому было высказано предположение (Stoscheck, 1990), что двухэтапный метод Лоури устарел. Однако модифицированный Лоури делается полностью при комнатной температуре. Версия анализа Лоури по Хартри, более поздняя модификация, которая использует меньше реагентов, улучшает чувствительность к некоторым белкам, с меньшей вероятностью будет несовместима с некоторыми солевыми растворами, обеспечивает более линейный ответ и с меньшей вероятностью станет насыщенной. Анализ Хартри-Лоури будет описан первым.

Различные белки дают разный ответ на метод Лоури. поэтому выберите определенный коммерчески доступный белок в качестве стандарта и продолжайте использовать его для всех своих экспериментов. Рекомендуется запускать образцы в двух экземплярах, хотя я запускаю их в трех экземплярах. В нашем случае всегда выполняйте пробелы, бланк является первым образцом стандартной кривой (0 мг БСА / л).
Анализ Брэдфорда (Bradford, 1976) стал колориметрическим методом выбора, главным образом благодаря его высокой чувствительности , воспринимаемая линейность и скорость анализа (Sapan et al., 1999). Анализ Брэдфорда основан на взаимодействии между основными аминокислотными остатками (прежде всего, аргинином, лизином и гистидином) с красителем Кумасси бриллиантового синего G-250 (CBB) в кислотной матрице. Связывание CBB с белками (или интерференция) приводит к спектральному сдвигу в синюю форму красителя. Напротив, анализ Лоури (Lowry et al., 1951) функционирует в щелочных условиях и включает две стадии: 1) реакция Биурета: основана на восстановлении Cu2 +, который затем связывается с белком, образующим пептидный комплекс Cu1 +, и 2) последующее восстановление реагента Фолина-Чокальтеу этим комплексом (Smith et al., 1985). В оригинальном формате, предложенном Lowry et al. (1951), анализ Лоури также дал ложное указание на белок в присутствии полифенолов, которые оба уменьшают реагент Фолина-Чокальтеу, способствуя поглощению в той же области спектра для белковые комплексы (~ 750 нм).

На колориметрические исследования почвенных экстрактов также сильно влияют физические помехи (рассеяние) и физико-химические эффекты от взвешенных глин (сорбция). Центрифугирование при 3000 × g не полностью удаляет сверхтонкую глинистую фракцию, которая является наиболее активной в этом процессе сорбции (Lozzi et al., 2008). В вышеупомянутом исследовании анализ Лоури был единственным методом, позволяющим получить правильные оценки белка. Помимо высокой чувствительности к остаточному содержанию глины, анализ Брэдфорда очень чувствителен ко времени, причем осаждение связанного с белком красителя происходит примерно через 10 минут после контакта. Это вводит ограничения в отношении количества образцов, измеряемых за цикл, снижая пропускную способность и скорость.

Материалы и метод:

 
1. Исходный раствор BSA (1 м / мл)?

 

2. Аналитические реагенты:

 

  
• 50 мл 2% карбоната натрия, смешанного с 50 мл 0,1 н раствора NAOH (0,4 г в 100 мл дистиллированной воды).