Экспериментальные методы исследования взаимодействия белок-ДНК классифицируются в двух формах, т.е. in vitro и in vivo. Исследования in vivo полезны из-за сохранения естественной структуры взаимодействия сторон. Однако в мультибелках трудно определить, какая часть белка напрямую связана с ДНК и защищает ее. Напротив, исследование in vitro подходит для очищенных белков и субъединиц белка.
В конце 1960-х годов были проведены первые исследования взаимодействия ДНК-белок. Анализ связывания нитроцеллюлозного фильтра был первым предложенным методом для этой цели. В 1990-х годах было разработано множество разнообразных экспериментальных методик для изучения взаимодействия ДНК-белок. На сегодняшний день доступно много методов для обнаружения и характеристики комплексов белок-нуклеиновая кислота, и большинство из них имеют свои преимущества и недостатки. Такие методы, включая, но не ограничиваясь этим, анализ электрофоретического сдвига подвижности (EMSA) (Fried 1989), ДНКаза I Footprinting (Brenowitz et al. 1986), Бактериальная одногибридная система и методы, основанные на анализе иммунопреципитации хроматина (ChIP), например. иммунопреципитация хроматина с помощью ДНК-микрочипа (ChIP-чип; Lieb et al. 2001), секвенирование иммунопреципитации хроматина (ChIP-Seq; Johnson et al. 2007), ChIP-exo (Pugh 2012) и иммунопреципитация хроматина с парными концевыми метками (ChIP -PET; Wu et al.2013) были использованы. Многие методы доступны для обнаружения и характеристики комплексов белок-нуклеиновая кислота, и большинство из них имеют преимущества и недостатки при определении и характеристике отношения ДНК-белок. Электрофоретический анализ изменения подвижности (EMSA); Анализ электрофоретического сдвига подвижности (также известный как «анализ сдвига полосы» и «электрофорез сдвига подвижности») имеет стандартный протокол для изучения широкого спектра взаимодействий нуклеиновая кислота-белок от одиночных белок-связывающих событий до сборки крупных комплексов, таких как сплайсосома (Malloy 2000; Rio 2014). Методика EMSA была впервые представлена Fried 1989, и в настоящее время многие варианты были описаны в литературе. EMSA – это простой, быстрый и очень чувствительный лабораторный метод для качественного тестирования специфического взаимодействия нуклеиновых кислот и белков, хотя при соответствующих условиях они используются для количественных целей.
Тем не менее, EMSA не без ограничений, и были встречены более важные ограничения и проблемы (Hellman and Fried 2007). Этот метод основан на наблюдении, что сегменты связывания нуклеиновой кислоты с белком вызывают уменьшение электрофоретической подвижности сегмента по сравнению со свободной нуклеиновой кислотой в агарозном геле в нативных условиях или неденатурирующем полиакриламидном геле (Vinckevicius and Chakravarti, 2012; Rio 2014). В этом методе сырая белковая смесь или очищенные белки смешиваются с последовательностью нуклеиновой кислоты в подходящем буфере, и может происходить специфическое связывание, стабильные комплексы нуклеиновой кислоты и белка (зонд может быть неспецифически связан другими белками) были разделены путем неденатурирующего гель-электрофореза; не только для изучения требований к последовательности нуклеиновых кислот для связывания, но также для разнообразных аспектов взаимодействия нуклеиновых кислот и белков, включая, но не ограничиваясь этим, кинетику связывания (такую как константы аффинности), идентификацию и характеристику белков связывания и требования кофактора. Широкий спектр длин нуклеиновых кислот и белков (от коротких олигонуклеотидов / аминокислот до нескольких тысяч) и различные структуры нуклеиновых кислот (одноцепочечные, дуплексные, триплексные и квадруплексные нуклеиновые кислоты, а также небольшие кольцевые ДНК) совместимы с методикой EMSA (Хеллман и Фрид 2007). Однако с помощью этой методики получается диапазон сайта связывания ДНК-секвенирования, он не обладает достаточной точностью при определении точного сайта и элементов кооперативного взаимодействия (более подробно см. Hellman and Fried 2007).
Дезоксирибонуклеаза I (DNaseI) Footprinting; Ценным методом не только для идентификации, но и для характеристики ДНК-белковых взаимодействий является метод DNaseI Footprint (Carey et al. 2013). Этот метод также используется для селективного распознавания последовательности ДНК-связывающих лигандов (Hampshire et al. 2007). Идея заключается в том, что селективно связывающийся с последовательностью белок защищает фосфодиэфирный остов ДНК внутри и вокруг ее сайта связывания от гидролиза, катализируемого ДНКазой I, таким образом, создает «след» в лестнице расщепления. ДНКаза I, которая неспецифически разрезает одну нить двухцепочечной спирали ДНК, которая не защищена, например, связывающий белок является удобной эндонуклеазой для обнаружения и определения местоположения последовательностей, селективно связывающих белки (Bailly et al., 2015). Сайты связывания визуализируются с помощью авторадиографии сегментов ДНК, полученных электрофорезом на денатурирующих гелях для секвенирования ДНК (Brenozwitz et al. 2001; Vinckevicius and Chakravarti, 2012). стерические препятствия, возникающие из-за ограниченного ДНК белка в этом сайте и рядом с ним, не позволяют DNaseI связываться непосредственно с сайтом связывания и 8-10 парами оснований вокруг него (Carey et al. 2013).
Несмотря на большую ценность вышеупомянутых методов, важность эффективности связывания белков с этими методами не распознается. Одним из решений для этой цели является использование репортерских анализов. Примерами этого являются гены хлорамфениколацетилтрансферазы, зеленого флуоресцентного белка и люциферазы на основе анализа. В этих методах измеряют область транскрипционных факторов в верхней области анализа клонированного репортера и его транскрипционную активность. Мутации в факторах транскрипции или их сайте связывания делают возможным анализ последовательностей или важных элементов во взаимодействии. Другой метод, основанный на репортерном анализе, заключается в образовании моногибридных и бигибридных систем в бактериях, которые вызывают выявление транскрипции в генах из-за взаимодействия многих белков, связывающих определенные области ДНК.
Мужчины очень долго правили в индустрии фитнеса. Не удивительно, что женщины в равной конкуренции соревнуются с мужчинами в индустрии фитнеса. Они также ищут идеальное тело,
Есть несколько разных циклов, вокруг которых вращается Земля. Некоторые из циклов были затронуты катастрофой Фукусима-Дайхатсу. Завод в Фукусиме пострадал от землетрясения силой 9,0 балла. Растения,
Этот эксперимент проводится для наблюдения за развитием эмбрионов перепелов в течение нескольких дней. Эмбрион перепела обычно развивается и выводится через 20-21 день. Мы провели эксперимент