Сочинение на тему Эксперимент по генетическому изменению кишечной палочки для экспрессии зеленого флуоресцентного белка с использованием плазмид

Использование плазмид для генетической трансформации E. Coli для экспрессии зеленого флуоресцентного белка

Аннотация

В этой лаборатории мы проверили трансформацию генов, вставив плазмиду pGLO в клетки E. Coli для экспрессии зеленого флуоресцентного белка. Мы предсказали, что только трансформированная кишечная палочка будет расти в присутствии ампициллина и экспрессировать GFP в присутствии арабинозы. Мы трансформировали бактерии посредством теплового шока, выращивали их на питательных чашках с ампициллином и рассчитывали эффективность трансформации. Результаты показали, что только кишечная палочка с плазмидой pGLO росла с ампициллином и экспрессировала GFP с арабинозой. Гипотеза была поддержана, потому что трансформированные бактерии обладали устойчивостью к антибиотикам, чтобы расти вместе с ампициллином, а арабиноза является промотором, необходимым для индукции признака GFP у E. Coli. Я узнал, насколько эффективны плазмиды для завершения трансформации генов, чтобы выразить определенную особенность.

Введение

Этот лабораторный эксперимент сфокусирован на генетической трансформации, которая представляет собой процесс изменения характеристик организма путем введения определенного гена (Aune et al. 2015). Этот процесс стал наиболее существенным в области медицины. Например, он использовался для изучения того, как определенные гены привели к развитию раковых опухолей фибробластов (Graf 1982). Другой целью генетической трансформации является получение очищенного белка, который может быть полезен в таких областях, как сельское хозяйство. Кроме того, генная трансформация использовалась для того, чтобы попытаться очистить гены от растений риса, которые можно использовать для регенерации этой культуры (Nishimura et al. 2005). Ген, который мы вставили, содержит зеленый флуоресцентный белок или GFP. GFP естественным образом содержится в медузе Aequorea victoria, позволяющей медузу светиться. Существуют разные методы, используемые для осуществления генетической трансформации, включая использование плазмиды. Плазмиды – это кольцевые ДНК, которые полезны для бактерий, в которых они находятся. Они обеспечивают бактерии с определенными генетическими характеристиками, которые они могут транспортировать к другим бактериям (Aune et al. 2015).

Основными задачами этой лаборатории было генетическое преобразование кишечной палочки, чтобы получить GFP, чтобы они светились зеленым. Это было сделано путем вставки GFP в E. Coli с использованием плазмиды pGLO. Эта плазмида была создана для того, чтобы иметь как GFP, так и ген, делающий бактерии устойчивыми к антибиотику ампициллину (Aune et al. 2015). Чтобы получить эту плазмиду в клетки E. Coli, мы использовали CaCl2 для создания дырок в клеточной мембране. Положительный заряд кальция нейтрализует отрицательный заряд клеточной мембраны, позволяя плазмиде проникать в клетку без отталкивания. Для экспрессии GFP промотор в плазмиде должен был быть индуцирован. Мы ввели сахар под названием арабиноза, чтобы вызвать промотор. Чтобы определить, экспрессируют ли бактерии ген, мы выращивали культуры на чашках с питательным бульоном. Некоторые из пластинок содержали ампициллин, ампициллин и арабинозу или не содержали ничего (Aune et al. 2015). Затем мы рассчитали эффективность преобразования пластин. Эффективность преобразования – это количественная величина, которая определяет, насколько эффективным был процесс преобразования. Это число может варьироваться от 8,0 х 102 до 7,0 х 103. После трансформации E. Coli GFP можно очищать с помощью колоночной хроматографии, которая используется для выделения определенных белков из нежелательных белков (Aune et al. 2015).

Наша гипотеза заключалась в том, что только E. Coli с плазмидой pGLO будет расти на чашках, содержащих ампициллин, и что только E. Coli на чашках, содержащих арабинозу, будет экспрессировать GFP под воздействием ультрафиолетового света. Мы думали, что чашки с ампициллином, которые содержат плазмиду, будут расти, потому что добавление плазмиды pGLO сделает бактерии устойчивыми к ампициллину на чашках. С другой стороны, ампициллин убивал бы бактерии, которые не содержали плазмиду. Только чашки с плазмидой и арабинозой будут светиться зеленым, потому что арабиноза необходима для индукции промотора в плазмиде, чтобы включить ген GFP. Без арабинозы не было бы ничего, что могло бы экспрессировать ген, а без плазмиды не было бы ничего, что могло бы вызвать арабинозу. Мы ожидали, что произойдет рост на чашке, которая содержала только кишечную палочку без плазмиды, потому что не было ампициллина для уничтожения бактерий (Aune et al. 2015). Для колоночной хроматографии мы ожидали, что только пробирка, содержащая очищенный GFP, будет светиться зеленым при ультрафиолетовом освещении.

Методы

250 мкл раствора для трансформации (CaCl2) добавляли в две пробирки (+ ДНК и -ДНК). Обе трубки были помещены в лед. Одна колония кишечной палочки была помещена в каждую пробирку с помощью стерильной петли, обеспечивающей полное рассеивание бактерий. 10 мкл плазмидной ДНК добавляли к + ДНК. Обе пробирки инкубируют во льду в течение 10 минут. Пробирки помещали в воду с температурой 42 ° С на 50 секунд, затем быстро помещали обратно на лед на две минуты. 250 мкл бульона LB добавляли в обе пробирки, и их инкубировали в течение 30 минут. 100 мкл раствора + ДНК добавляли в две чашки с агаром: (+) LB / amp, который содержал ампициллин, и (+) LB / amp / ara, который содержал ампициллин и арабинозу. 100 мкл раствора -ДНК добавляли в две чашки с агаром: (-) LB / amp, который содержал ампициллин, и (-) LB, который являлся контролем. Планшеты инкубируют в течение двух дней. Пластины были исследованы при нормальном и ультрафиолетовом освещении, и наблюдения были записаны.