Эксперимент по генетическому изменению кишечной палочки для экспрессии зеленого флуоресцентного белка с использованием плазмид сочинение пример

ООО "Сочинения-Про"

Ежедневно 8:00–20:00

Санкт-Петербург

Ленинский проспект, 140Ж

Сочинение на тему Эксперимент по генетическому изменению кишечной палочки для экспрессии зеленого флуоресцентного белка с использованием плазмид

Использование плазмид для генетической трансформации E. Coli для экспрессии зеленого флуоресцентного белка

Аннотация

В этой лаборатории мы проверили трансформацию генов, вставив плазмиду pGLO в клетки E. Coli для экспрессии зеленого флуоресцентного белка. Мы предсказали, что только трансформированная кишечная палочка будет расти в присутствии ампициллина и экспрессировать GFP в присутствии арабинозы. Мы трансформировали бактерии посредством теплового шока, выращивали их на питательных чашках с ампициллином и рассчитывали эффективность трансформации. Результаты показали, что только кишечная палочка с плазмидой pGLO росла с ампициллином и экспрессировала GFP с арабинозой. Гипотеза была поддержана, потому что трансформированные бактерии обладали устойчивостью к антибиотикам, чтобы расти вместе с ампициллином, а арабиноза является промотором, необходимым для индукции признака GFP у E. Coli. Я узнал, насколько эффективны плазмиды для завершения трансформации генов, чтобы выразить определенную особенность.

Введение

Этот лабораторный эксперимент сфокусирован на генетической трансформации, которая представляет собой процесс изменения характеристик организма путем введения определенного гена (Aune et al. 2015). Этот процесс стал наиболее существенным в области медицины. Например, он использовался для изучения того, как определенные гены привели к развитию раковых опухолей фибробластов (Graf 1982). Другой целью генетической трансформации является получение очищенного белка, который может быть полезен в таких областях, как сельское хозяйство. Кроме того, генная трансформация использовалась для того, чтобы попытаться очистить гены от растений риса, которые можно использовать для регенерации этой культуры (Nishimura et al. 2005). Ген, который мы вставили, содержит зеленый флуоресцентный белок или GFP. GFP естественным образом содержится в медузе Aequorea victoria, позволяющей медузу светиться. Существуют разные методы, используемые для осуществления генетической трансформации, включая использование плазмиды. Плазмиды – это кольцевые ДНК, которые полезны для бактерий, в которых они находятся. Они обеспечивают бактерии с определенными генетическими характеристиками, которые они могут транспортировать к другим бактериям (Aune et al. 2015).

Основными задачами этой лаборатории было генетическое преобразование кишечной палочки, чтобы получить GFP, чтобы они светились зеленым. Это было сделано путем вставки GFP в E. Coli с использованием плазмиды pGLO. Эта плазмида была создана для того, чтобы иметь как GFP, так и ген, делающий бактерии устойчивыми к антибиотику ампициллину (Aune et al. 2015). Чтобы получить эту плазмиду в клетки E. Coli, мы использовали CaCl2 для создания дырок в клеточной мембране. Положительный заряд кальция нейтрализует отрицательный заряд клеточной мембраны, позволяя плазмиде проникать в клетку без отталкивания. Для экспрессии GFP промотор в плазмиде должен был быть индуцирован. Мы ввели сахар под названием арабиноза, чтобы вызвать промотор. Чтобы определить, экспрессируют ли бактерии ген, мы выращивали культуры на чашках с питательным бульоном. Некоторые из пластинок содержали ампициллин, ампициллин и арабинозу или не содержали ничего (Aune et al. 2015). Затем мы рассчитали эффективность преобразования пластин. Эффективность преобразования – это количественная величина, которая определяет, насколько эффективным был процесс преобразования. Это число может варьироваться от 8,0 х 102 до 7,0 х 103. После трансформации E. Coli GFP можно очищать с помощью колоночной хроматографии, которая используется для выделения определенных белков из нежелательных белков (Aune et al. 2015).

Наша гипотеза заключалась в том, что только E. Coli с плазмидой pGLO будет расти на чашках, содержащих ампициллин, и что только E. Coli на чашках, содержащих арабинозу, будет экспрессировать GFP под воздействием ультрафиолетового света. Мы думали, что чашки с ампициллином, которые содержат плазмиду, будут расти, потому что добавление плазмиды pGLO сделает бактерии устойчивыми к ампициллину на чашках. С другой стороны, ампициллин убивал бы бактерии, которые не содержали плазмиду. Только чашки с плазмидой и арабинозой будут светиться зеленым, потому что арабиноза необходима для индукции промотора в плазмиде, чтобы включить ген GFP. Без арабинозы не было бы ничего, что могло бы экспрессировать ген, а без плазмиды не было бы ничего, что могло бы вызвать арабинозу. Мы ожидали, что произойдет рост на чашке, которая содержала только кишечную палочку без плазмиды, потому что не было ампициллина для уничтожения бактерий (Aune et al. 2015). Для колоночной хроматографии мы ожидали, что только пробирка, содержащая очищенный GFP, будет светиться зеленым при ультрафиолетовом освещении.

Методы

250 мкл раствора для трансформации (CaCl2) добавляли в две пробирки (+ ДНК и -ДНК). Обе трубки были помещены в лед. Одна колония кишечной палочки была помещена в каждую пробирку с помощью стерильной петли, обеспечивающей полное рассеивание бактерий. 10 мкл плазмидной ДНК добавляли к + ДНК. Обе пробирки инкубируют во льду в течение 10 минут. Пробирки помещали в воду с температурой 42 ° С на 50 секунд, затем быстро помещали обратно на лед на две минуты. 250 мкл бульона LB добавляли в обе пробирки, и их инкубировали в течение 30 минут. 100 мкл раствора + ДНК добавляли в две чашки с агаром: (+) LB / amp, который содержал ампициллин, и (+) LB / amp / ara, который содержал ампициллин и арабинозу. 100 мкл раствора -ДНК добавляли в две чашки с агаром: (-) LB / amp, который содержал ампициллин, и (-) LB, который являлся контролем. Планшеты инкубируют в течение двух дней. Пластины были исследованы при нормальном и ультрафиолетовом освещении, и наблюдения были записаны.

Затем были выполнены расчеты эффективности преобразования. Общее количество использованной ДНК определяли путем умножения концентрации ДНК (0,03 мкг / мкл) на объем ДНК (10 мкл). Фракцию ДНК, которая была помещена на пластину LB / amp / ara, определяли путем деления объема распределения ДНК (100 мкл) на общий объем жидкости, в которой находилась ДНК (510 мкл). Количество ДНК, распределенной по чашке, определяли путем умножения общего количества ДНК (мкг) на долю распространения ДНК. Эффективность трансформации была найдена путем деления количества колоний, которые выросли на чашке LB / amp / ara, на количество ДНК, распространенной на чашке.

Обсуждение

Наша гипотеза о том, что только E.coli с плазмидой pGLO будет расти на чашках, содержащих ампициллин, полностью подтверждается нашими данными. В таблице 1 показано, как чашки, содержащие + ДНК, имели примерно одинаковый рост (360 и 352 колонии). Обе эти чашки содержали ампициллин и E. Coli с плазмидой. На пластине (-) LB / amp не было колоний. На этой пластине присутствовал ампициллин, но в бактериях не было плазмиды. Это подтверждает нашу гипотезу о том, как только бактерии с плазмидой смогут расти в присутствии ампициллина. Наша гипотеза о том, что только кишечная палочка на чашках, содержащих арабинозу, будет экспрессировать GFP в ультрафиолетовом свете, также полностью подтверждается нашими данными. Таблица 1 показывает цвет пластин, которые находились как под нормальным, так и под ультрафиолетовым светом. При обычном освещении обе чашки, содержащие плазмиду (+ ДНК), были белыми. Только (+) пластина LB / amp / ara светилась зеленым светом в ультрафиолетовом свете. Это единственная пластинка, которая содержала арабинозу, так что это подтверждает нашу гипотезу о том, что арабиноза помогает экспрессировать флуоресцентный ген. (-) LB / amp не был цветным, потому что там вообще не было бактерий.

Таблица 2 показывает различные расчеты эффективности трансформации наших бактерий. Наша эффективность (5,99 x 103) находится в диапазоне от 8,0 x 102 до 7,0 x 103. Эффективность преобразования – это показатель того, насколько хорошо получилось преобразование. Так как наш результат лежит к более высокому концу спектра, мы можем предположить, что наша трансформация прошла успешно, поэтому бактерии на чашках + ДНК действительно имели плазмиду внутри себя (Aune et al. 2015). Таблица 3 сравнивает различные вычисления эффективности преобразования, найденные в классе. Группа с наименьшим количеством колоний, выращенных на чашке (30), также имела самую низкую эффективность трансформации (5,10 × 102). Группа с наибольшим количеством колоний (1568) также имела самый высокий расчет (2,6 х 104). Это подтверждает идею о том, что существует связь между тем, насколько хорошо было проведено преобразование и насколько устойчивы бактерии к ампициллину. Если бы трансформация работала очень хорошо, в бактериях было бы больше плазмиды, что сделало бы ее более устойчивой к ампициллину и позволило бы ей расти более эффективно (Aune et al. 2015).

В нашем эксперименте результаты хорошо совпали с нашей гипотезой, поэтому, если были какие-либо ошибки, они были незначительными. Возможные ошибки, которые могли произойти в лаборатории, включают время между медленным перемещением пробирок от 42 ° C до слишком медленного льда. Если бы результаты экспрессии GFP не ожидались, это могло произойти из-за неработающей арабинозы. Доказательства того, что наши результаты не были неточными, можно найти, так как мы использовали контроль. Пластина (-) LB использовалась, чтобы увидеть, как бактерии будут процветать без каких-либо переменных. Таблица 1 показывает, как эта пластинка очень хорошо росла и была как белой в обычном, так и в ультрафиолетовом свете. Отсюда можно предположить, что сами бактерии не могли быть источником ошибки. Процесс очистки белка с помощью колоночной хроматографии позволил отделить GFP от загрязняющих бактерий. Этот метод может применяться для решения реальных проблем. Например, очистка собачьих аденовирусных векторов с помощью хроматографии жизненно важна для создания вакцин против респираторных заболеваний у собак (Segura et al. 2012).

Заключение

В этой лаборатории я узнал, что процесс трансформации генов очень полезен для того, чтобы заставить клетку выразить определенную черту. Использование плазмид является очень точным методом демонстрации этого процесса. Поскольку плазмиды встречаются в природе в бактериях, вставка нужного гена в плазмиду для помещения в бактерии делает процесс трансформации эффективным (Aune et al. 2015). Я также узнал, что нужен не только метод вставки гена в клетку, но также должен присутствовать промотор, чтобы вызвать признак. Это подтверждается нашими результатами того, как бактерии, содержащие плазмиду pGLO, экспрессировали GFP только в присутствии арабинозы. Теперь у меня есть более полное понимание важности генной трансформации и того, как ее можно использовать для очистки белка для различных областей.

Поделиться сочинением
Ещё сочинения
Нет времени делать работу? Закажите!

Отправляя форму, вы соглашаетесь с политикой конфиденциальности и обработкой ваших персональных данных.