Сочинение на тему CRISPR-Cas как новый инструмент для редактирования генома
- Опубликовано: 19.08.2020
- Предмет: Наука
- Темы: генетика, Научный метод, Проект генома человека, эксперимент
Аннотация
CRISPR-Cas9 (кластеризованные регулируемые межпространственные короткие палиндромные повторы) является крупным прорывом в редактировании генов. Многие ученые считают, что CRISPR Cas9 является наиболее эффективным и действенным инструментом для проведения таких экспериментов.
В настоящее время ученые используют его для редактирования бактериальных геномов, чтобы справиться с эпидемическими болезнями, вызываемыми бактериями, и повысить урожайность. Уже есть много видов бактерий, которые были успешно отредактированы с помощью CRISPR / Cas9.Он может, например, регулировать бактериальную вирулентность и быть индикатором устойчивости к антибиотикам некоторых патогенных бактерий. Сам CRISPR-Cas модернизировал классификацию и эволюционное картирование бактерий.
Однако у некоторых видов есть несколько проблем. Другие виды по-прежнему не редактируются из-за несовместимости с самим CRISPR Cas, в частности из-за нестабильности целевой бактерии и потому, что CRISPR / Cas может быть токсичным для некоторых бактерий.
Следует ожидать, что CRISPR Cas все еще сможет быть улучшен таким образом, что он сможет вводить новшества в мир молекулярной биологии, однако не раньше, чем через десять лет, как и предполагалось изначально.
Цель
Общая цель этого обзора литературы состояла в том, чтобы подготовить всеобъемлющий литературный документ, посвященный CRISPR / Cas и поиску успешно отредактированных геномом бактерий с использованием Cas9, а также решению проблем и задач, с которыми столкнулся CRISPR / Cas9.
История системы CRISPR / Cas9
Двадцать три года назад ученые начали углубляться в структуру бактериальной ДНК, и ученый Франциско Мохика открыл CRISPR (кластерные регулируемые межпространственные короткие палиндромные повторы). В 2005 году Александр Болотин нашел Cas9 PAM (Protospacer-смежные мотивы). В период с 2005 по 2013 годы многие ученые внесли свой вклад в создание системы CRISPR / Cas9. К 2011 году tracrRNA для системы Cas9 была обнаружена Emmanuelle Charpentie, а расщепление, опосредованное Cas9, было биохимически охарактеризовано Virginijus Siksnys. В 2013 году CRISPR-Cas9 был впервые успешно применен в редактировании генома в эукариотических клетках Фенгом Чжаном. CRISPR взорвался за последние четыре года, демонстрируя экспоненциальный рост, и в конце концов о нем сообщили Эммануэль Шарпантье и Дженнифер Дудна к 2013 году. История CRISPR / Cas длинна и полна работы, проделанной многими похвальными учеными, и само будущее ярко.
Связанный с CRISPR белок или белок CAS
CRISPR-ассоциированные белки (Cas-белки) выполняют две роли. Первый – это использование ими хранимой информации о последовательности для идентификации вирусов или чужеродных геномов и их уничтожения. Второе – это участие в получении и хранении сегментов вирусной последовательности.
Существуют различные типы систем CRISPR (типы I-III), и белки Cas обычно примыкают к системе CRISPR и служат основой для классификации трех различных типов систем CRISPR. Системы CRISPR типов I и III содержат несколько белков Cas, тогда как система типа II в основном использует белки Cas9. Со времени первоначальных исследований система CRISPR-Cas9 использовалась тысячами лабораторий для приложений редактирования генома в различных экспериментальных системах.
Cas9 в паре с системой CRISPR типа II, которая в основном встречается у бактерий рода Streptococcus. Одним из наиболее широко известных используемых белков Cas является Streptococcus pyogenes Cas9 (spCas9). Белок Cas9 является одним из наиболее важных компонентов для инженерных геномов. Белок Cas9 связывается с гибридом crRNA / tracrRNA, который действует как руководство для белка. Кодируемая прото-спейсером часть кРНК направляет белок Cas9 на расщепление последовательностей комплементарной ДНК-мишени, если они примыкают к коротким последовательностям, известным как мотивы смежных с протоспакерами (PAM).
Механизм CRISPR / CAS
Система защиты CRISPR требует транскрипции массива повторов-спейсеров из лидерной последовательности, которая действует как промотор, и используется в сочетании с системой РНК-процессинга, содержащей восемь генов, называемых генами Cas (CRISPR-ассоциированные). В E. Coli эти гены называются K12 и обычно расположены рядом с каждым локусом CRISPR. Гены Cas кодируют различные РНК-связывающие белки, полимеразы и нуклеазы (как ДНК, так и РНК). Существует три основных семейства генов CRISPR / Cas, в зависимости от конкретных белков Cas в геноме. Существует мультимерный комплекс под названием Cascade (CRISPR-ассоциированный комплекс для антивирусной защиты), состоящий из пяти белков Cas и ответственный не только за стадию интерференции, но и за стадию адаптации, которая обрабатывает чужеродного захватчика для включения в CRISPR. локус.
Область CRISPR транскрибируется в длинную РНК (пре-кРНК), которая перерабатывается в короткие РНК CRISPR, состоящие из примерно 57 нуклеотидов, содержащих спейсер, окруженный двумя консервативными частичными повторами, PAM (мотивы, соседствующие с протоспейсером). Эти спейсерные / PAM РНК, которые являются комплементарными последовательностям протоспейсерной ДНК фага, впоследствии используются в качестве направляющих для механизма вмешательства Cas. Спаривание инициируется высокоаффинной последовательностью семян на любом конце спейсерной последовательности кРНК.
Комплексное основание совпадает с вирусной ДНК или РНК для предотвращения экспрессии генов фага и, в конечном итоге, приводит к деградации. Мутации либо в последовательности ядра семян спейсерной ДНК, либо в последовательности PAM аннулируют иммунитет CRISPR / Cas, изменяя связывание. Эти механизмы предлагают мощные подходы для выключения генов по желанию и изменения экспрессии генов. Хотя это не обязательно односторонний процесс, когда производится регуляторная РНК, которая отключает экспрессию сообщения. Этот метод также может быть сбалансирован путем производства встречного белка, который может связываться с мРНК и мешать ей. Могут существовать динамические системы, которые со временем могут меняться в зависимости от требований к ячейке.
Механизм CRISPR / Cas (Рихтер, Чанг и Файнран, 2012):
- Этап I: адаптация.
- Этап II: вмешательство.
Это связано с проникновением чужеродной ДНК в клетку путем трансформации, конъюгации или трансдукции, которые могут привести к приобретению нового спейсера (ов) ДНК с помощью адаптационного комплекса Cas (неизвестная сборка белка). Если спейсер не получен, фагелитный цикл или репликация плазмиды могут продолжаться.
Мешающие комплексы Cas связаны с кРНК, полученной в результате транскрипции локуса CRISPR и последующей обработки. Клетка, несущая кРНК, нацеленная на область (путем идеального спаривания) чужеродной нуклеиновой кислоты, может вмешиваться в инвазивный генетический материал и разрушать его посредством интерференционного комплекса Cas (неизвестное соединение белка, за исключением каскада в Escherichia coli). Если не существует идеального спаривания между спейсером и протоспейсером (как в случае с фаговым мутантом), системе CRISPR / Cas противодействуют и может произойти репликация инвазивного генетического материала.
Важность бактерий и их функции в системе CRISPR / Cas
Escherichia coli сыграла большую роль в открытии системы CRISPR / Cas, поскольку это была первая бактерия, в которой исследователи обнаружили повторяющиеся последовательности ДНК, которые впоследствии оказались частью системы CRISPR / Cas бактерии. Исследователи впервые обнаружили нежелательную ДНК. Исследователи обнаружили, что эта CRISPR-ДНК является частью прокариотического эквивалента иммунной системы, защищающей бактерии от вирусных инфекций.
Принцип, лежащий в основе системы CRISPR-Cas, сродни так называемой интерференции РНК в эукариотических клетках.
У бактерий штамма Streptococcus pyogenes этот принцип упрощен до такой степени, что для защиты требуются только две молекулы РНК и фермент Cas9. Естественно, белок Cas9 связывается с гибридом crRNA / tracrRNA, который действует как руководство для белка. Это может быть заменено синтетической sgRNA (однонаправленной РНК), которая не ограничивает функцию Cas9 и позволяет осуществлять целевое редактирование генома. Белок Cas9 в основном обнаружен в штамме Streptococcus pyogenes. Меньшая версия Cas9 может быть найдена у Streptococcus aureus. Меньший размер облегчает вставку белка в зрелые клетки и, таким образом, преодолевает одно из ограничений обычного фермента Cas9.
Применение CRISPR Cas9
<Ол>
Большое разнообразие важных патогенов млекопитающих имеют системы CRISPR-Cas типа II, включая большинство патогенов, таких как L. monocytogenes, S. pyogenes, Streptococcus agalactiae, Neisseria meningitides, C. jejuni, Haemophilus influenza и Helicobacter pylori. Действительно, отсутствие или делеция генов Cas может привести к увеличению устойчивости к антибиотикам и поглощению фагов. [1]
Однако в другом случае, когда отсутствовала система CRISPR-Cas, добавленный белок Cas9 приводил к значительному увеличению вирулентности.
Как и в случае с Enterococcus faecalis. Сам ген Cas9 играет роль в конструировании бактерий, что должно быть против переноса плазмиды с конъюгированной антибиотикорезистентностью в Enterococcus faecalis (грамположительная бактерия). Обнаружено, что CRISPR-Cas и рестрикционно-модифицирующие системы функционируют как адаптивные и врожденные Иммунная система у бактерий значительно влияет на распространение генов устойчивости к антибиотикам в E. faecalispopulation. Потеря этих систем у E. faecalissus высокого риска свидетельствует о том, что они страдают иммунодефицитом, исчезают, что позволяет им легко приобретать новые гены и адаптироваться к новым антибиотикам. Мобильные генетические элементы (МГЭ), такие как конъюгированные и мобилизуемые плазмиды и транспозоны, широко распространены в клинические изоляты E. faecalis. Они кодируют устойчивость к ванкомицину, аминогликозидам, тетрациклину, хлорамфениколу, ампициллину, линезолиду и другим антибиотикам.
Чтобы обеспечить иммунитет к MGE, CRISPR транскрибируется в pre-CRISPR RNA (pre-crRNA) и обрабатывается до зрелых crRNAs с использованием RNase III, Cas9 и атранс-активирующей crRNA (tracrRNA), которая имеет комплементарность последовательности к повторам CRISPR. , Это фаза выражения. Если MGE, обладающий протоспейсером и PAM (соседним с Protospacer мотивом), проникает в клетку, нуклеаза Cas9 направляется в геном MGE с помощью crRNA / tracrRNAcomplex с комплементарностью последовательности к протоспасеру. [2] Эндонуклеазный домен HNH в Cas9 расщепляет комплементарную цепь протоспейсера, а эндонуклеазный домен RuvC в Cas9 расщепляет некомплементарную цепь протоспейсера, генерируя разрыв двухцепочечной ДНК (дцДНК) во вторгающемся MGE. Это интерференционная фаза. Таким образом, системы CRISPR-Cas типа II обеспечивают адаптивный иммунитет против MGEs. [3]
Эволюция микроорганизмов всегда сопровождается многочисленными изменениями их генетических кодов и органелл, таких как варианты типов Cas9. С тех пор, как была обнаружена система CRISPR / Cas9, существует еще один способ определения классификации бактерий. Даже если это может усложнить и внести большие изменения в филогеническое древо бактерий, это может помочь микробиологам более точно картировать и переставлять типы бактерий.
До настоящего времени это успешно использовалось для некоторых грамположительных (Lactobacillus reuteri) и отрицательных (Francisellanovicida) бактерий, а также цианобактерий (Synechococcus).
Проблемы и проблемы
<Ол>
На основании эксперимента с Cyanobacterium Synechococcuselongatus UTEX 2973 белки Cas9 могут быть токсичными для своего хозяина на некотором уровне. Дело в том, что только пять колоний Synechococcus были получены в результате конъюгации в среде, содержащей умеренные уровни белка Cas9, тогда как в среде, в которой отсутствовал Cas9, было 250 колоний. Нет никакой известной причины для этого, но одна возможность состоит в том, что S. pyogenes Cas9 имеет нецелевые эффекты в цианобактериальных клетках. Фермент может расщеплять геномные ДНК в областях, отличных от тех, на которые нацелена синтетическая РНК, и что клетка не может восстановить эти разрывы, что приводит к летальности. Решение состоит в том, что выражение Cas9 должно происходить временным образом, чтобы добиться успешного редактирования. Тот факт, что успех редактирования зависит от кратковременной экспрессии Cas9 в одном штамме цианобактерий, предполагает, что токсичность Cas9 может быть причиной, по которой применение редактирования CRISPR / Cas9 в цианобактериях отстает от применения других организмов. [5]
Стабильности бактериального генома постоянно угрожают внешние агенты, такие как мобильные элементы или фаги, а также работа их собственных систем репликации и репарации ДНК на связанных или повторяющихся последовательностях. Растущая популяция бактерий развивает баланс между поддержанием генома и нестабильностью, который зависит от типа бактерии, клеточного цикла и окружающей среды. Кроме того, бактерии используют нестабильность генома для увеличения разнообразия генов и контроля экспрессии генов и реакции на различные стрессы. CRISPR / Cas9 как антитело защищает бактерию от экзогенных веществ и разрушает их. Кроме того, его можно использовать для редактирования бактериальных геномов. Нестабильность бактериальных геномов может нарушать работу Cas9 как части системы антител и инструментов редактирования. [6] В случае инструмента редактирования это нарушило бы функцию Cas9 и изменило бы ее цель. Это приводит к нежелательным побочным эффектам.
Источники
Louwen R, Сталс RHJ, Endtz HP, ван Ба …
Этот эксперимент проводится для наблюдения за развитием эмбрионов перепелов в течение нескольких дней. Эмбрион перепела обычно развивается и выводится через 20-21 день. Мы провели эксперимент
В своем задании я расскажу вам о «теории использования и удовлетворения». Эта теория отличается и не похожа на другие теории средств массовой информации. Другие теории
То, что наши глаза сейчас смотрят вокруг, все состоит из элементов различного рода, они состоят из крошечных атомов и состоят из субатомных частиц, таких как