Разделительная хроматография была одним из первых видов хроматографии, которые разработали химики. [8] Принцип коэффициента распределения был применен к бумажной хроматографии, тонкослойной хроматографии, газовой фазе и разделению жидкости и жидкости. Нобелевскую премию по химии 1952 года получили Арчер Джон Портер Мартин и Ричард Лоуренс Миллингтон Синдж за разработку методики, которая использовалась для разделения аминокислот [9]. Разделительная хроматография использует задержанный растворитель на поверхности или внутри зерен или волокон «инертной» твердой поддерживающей матрицы, как при бумажной хроматографии; или использует некоторое взаимодействие кулоновского и / или водородного донора со стационарной фазой. Анализируемые молекулы распределяются между жидкой стационарной фазой и элюентом. Как и в хроматографии с гидрофильным взаимодействием (HILIC; подтехника в ВЭЖХ), этот метод разделяет аналиты на основе различий в их полярности. HILIC чаще всего использует связанную полярную стационарную фазу и подвижную фазу, состоящую в основном из ацетонитрила с водой в качестве сильного компонента. Разделение ВЭЖХ исторически использовалось на несвязанных носителях из диоксида кремния или оксида алюминия.
Каждый работает эффективно для разделения аналитов по относительным полярным различиям. Преимущественно связанные с HILIC фазы разделяют кислые, основные и нейтральные растворенные вещества в одном хроматографическом цикле. [10] Полярные аналиты диффундируют в стационарный водный слой, связанный с полярной стационарной фазой, и, таким образом, сохраняются. Чем сильнее взаимодействия между полярным анализируемым веществом и полярной стационарной фазой (относительно подвижной фазы), тем дольше время элюирования. Сила взаимодействия зависит от части функциональных групп молекулярной структуры аналита с более поляризованными группами (например, гидроксильными) и группами, способными к образованию водородных связей, вызывающими большее удержание. Кулоновские (электростатические) взаимодействия также могут увеличить удержание. Использование более полярных растворителей в подвижной фазе уменьшит время удерживания аналитов, тогда как более гидрофобные растворители имеют тенденцию увеличивать время удерживания. Нормально-фазовая хроматография Нормально-фазовая хроматография была одним из первых видов ВЭЖХ, разработанных химиками.
Этот метод, также известный как ВЭЖХ с нормальной фазой (NP-HPLC), разделяет аналиты на основе их сродства к полярной неподвижной поверхности, такой как диоксид кремния, поэтому он основан на способности аналита участвовать в полярных взаимодействиях (таких как водородные связи). или диполь-дипольный тип взаимодействия) с поверхностью сорбента. NP-HPLC использует неполярную неводную подвижную фазу (например, хлороформ) и эффективно работает для разделения аналитов, легко растворимых в неполярных растворителях. Аналит связывается и удерживается полярной стационарной фазой. Сила адсорбции увеличивается с увеличением полярности аналита. Сила взаимодействия зависит не только от функциональных групп, присутствующих в структуре молекулы аналита, но и от стерических факторов. Влияние стерических помех на силу взаимодействия позволяет этому методу разделять (разделять) структурные изомеры. Использование более полярных растворителей в подвижной фазе уменьшит время удерживания аналитов, тогда как более гидрофобные растворители имеют тенденцию вызывать более медленное элюирование (увеличенное время удерживания). Очень полярные растворители, такие как следы воды в подвижной фазе, имеют тенденцию адсорбироваться на твердой поверхности стационарной фазы, образуя неподвижный связанный (водный) слой, который, как считается, играет активную роль в удерживании. Это поведение в некоторой степени свойственно нормальной хроматографии, потому что оно регулируется почти исключительно адсорбционным механизмом (т.е. аналиты взаимодействуют с твердой поверхностью, а не с сольватированным слоем лиганда, прикрепленным к поверхности сорбента; см. Также ВЭЖХ с обращенной фазой ниже) , Адсорбционная хроматография все еще широко используется для разделения структурных изомеров как в колоночной, так и в тонкослойной хроматографии на подложках из активированного (высушенного) диоксида кремния или оксида алюминия.
Разделительная и NP-HPLC потеряли популярность в 1970-х годах с развитием ВЭЖХ с обращенной фазой из-за плохой воспроизводимости времени удержания из-за присутствия слоя воды или протонного органического растворителя на поверхности кремнезема или глиноземные хроматографические среды. Этот слой изменяется с любыми изменениями в составе подвижной фазы (например, уровнем влажности), вызывающими время удержания дрейфа. В последнее время разделительная хроматография снова стала популярной благодаря разработке фаз, связанных с Hilic, которые демонстрируют улучшенную воспроизводимость и благодаря лучшему пониманию диапазона полезности метода. Хроматография смещения Основным принципом хроматографии смещения является: молекула с высоким сродством к матрице хроматографии (смещатель) будет эффективно конкурировать за сайты связывания и, таким образом, вытеснит все молекулы с меньшим сродством. [11] Есть четкие различия между вытеснительной и элюирующей хроматографией. В режиме элюирования вещества обычно выходят из колонны в узких гауссовых пиках. Широкое разделение пиков, предпочтительно до базовой линии, желательно для достижения максимальной очистки. Скорость, с которой любой компонент смеси движется вниз по колонне в режиме элюирования, зависит от многих факторов. Но для того, чтобы два вещества перемещались с разными скоростями и, следовательно, были разрешены, должны быть существенные различия в некотором взаимодействии между биомолекулами и хроматографической матрицей.
Рабочие параметры настраиваются, чтобы максимизировать влияние этой разницы. Во многих случаях базовое разделение пиков может быть достигнуто только при градиентном элюировании и низких нагрузках на колонку. Таким образом, двумя недостатками хроматографии в режиме элюирования, особенно в препаративном масштабе, являются сложность эксплуатации из-за градиентной откачки растворителя и низкая пропускная способность из-за низких нагрузок на колонку. Смещающая хроматография имеет преимущества перед элюционной хроматографией в том, что компоненты разделяются в последовательные зоны чистых веществ, а не в «пики». Поскольку в процессе используется преимущество нелинейности изотерм, на данную колонку можно разделить более крупную подачу из колонки с очищенными компонентами, извлеченными при значительно более высокой концентрации.
Обращенно-фазовая хроматография (RPC) Хроматограмма сложной смеси (парфюмерная вода), полученной с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Подробнее об этой теме см. Обращенно-фазовая хроматография. ВЭЖХ с обращенной фазой (RP-HPLC) имеет неполярную стационарную фазу и водную умеренно полярную подвижную фазу. Одна обычная стационарная фаза представляет собой диоксид кремния, который был модифицирован на поверхности с помощью RMe2SiCl, где R представляет собой алкильную группу с прямой цепью, такую как C18H37 или C8H17. С такими стационарными фазами время удерживания больше для молекул, которые менее полярны, в то время как полярные молекулы элюируются легче (в начале анализа). Исследователь может увеличить время удержания, добавляя больше воды в подвижную фазу; тем самым усиливая сродство гидрофобного аналита к гидрофобной стационарной фазе по сравнению с более гидрофильной подвижной фазой. Точно так же исследователь может уменьшить время удерживания, добавляя больше органического растворителя к элюенту. RP-HPLC используется так часто, что его часто неправильно называют «ВЭЖХ» без дополнительной спецификации. Фармацевтическая промышленность регулярно применяет RP-HPLC для квалификации лекарств перед их выпуском. RP-HPLC работает по принципу гидрофобных взаимодействий, который происходит из-за высокой симметрии в дипольной структуре воды и играет наиболее важную роль во всех процессах в науке о жизни. RP-HPLC позволяет измерять эти интерактивные силы.
Связывание аналита со стационарной фазой пропорционально площади поверхности контакта вокруг неполярного сегмента молекулы аналита при ассоциации с лигандом в неподвижной фазе. В этом солвофобном эффекте преобладает сила воды для «сокращения полости» вокруг аналита и цепи C18 по сравнению с комплексом обоих. Энергия, выделяемая в этом процессе, пропорциональна поверхностному натяжению элюента (вода: 7,3 × 10-6 Дж / см², метанол: 2,2 × 10-6 Дж / см²) и гидрофобной поверхности аналита и лиганда соответственно , Удержание может быть уменьшено путем добавления менее подвижного растворителя (метанол, ацетонитрил) в подвижную фазу, чтобы уменьшить поверхностное натяжение воды. Градиентное элюирование использует этот эффект, автоматически уменьшая полярность и поверхностное натяжение водной подвижной фазы в ходе анализа. Структурные свойства молекулы аналита играют важную роль в его удерживающих характеристиках. В общем, аналит с большей гидрофобной площадью поверхности (C – H, C – C и обычно неполярными атомными связями, такими как S-S и др.) Сохраняется дольше, потому что он не взаимодействует со структурой воды.
С другой стороны, аналиты с более высокой площадью полярной поверхности (обусловленные наличием полярных групп, таких как -OH, -NH2, COO- или -NH3 + в их структуре) менее сохраняются, поскольку они лучше интегрируются в вода. Такие взаимодействия подвержены стерическим эффектам в том смысле, что очень большие молекулы могут иметь только ограниченный доступ к порам стационарной фазы, где имеют место взаимодействия с поверхностными лигандами (алкильными цепями). Такое поверхностное препятствие обычно приводит к меньшей задержке. Время удерживания увеличивается с увеличением гидрофобной (неполярной) площади поверхности. Соединения с разветвленной цепью элюируются быстрее, чем их соответствующие линейные изомеры, потому что общая площадь поверхности уменьшается. Аналогичным образом, органические соединения с одинарными связями C – C элюируются позже, чем соединения с тройной связью C = C или C – C, поскольку двойная или тройная связь короче, чем простая связь C – C. Помимо поверхностного натяжения подвижной фазы (организационная сила в структуре элюента), другие модификаторы подвижной фазы могут влиять на удержание аналита. Например, добавление неорганических солей вызывает умеренное линейное увеличение поверхностного натяжения водных растворов (примерно 1,5 × 10-7 Дж / см² на моль для NaCl, 2,5 × 10-7 Дж / см² на моль для (NH4) 2SO4), и поскольку энтропия границы раздела аналит-растворитель контролируется поверхностным натяжением, добавление солей имеет тенденцию увеличивать время удерживания. Этот метод используется для мягкого разделения и восстановления белков и защиты их биологической активности при анализе белков (хроматография гидрофобного взаимодействия, HIC).
Другим важным фактором является рН подвижной фазы, поскольку он может изменить гидрофобный характер аналита. По этой причине большинство методов используют буферный агент, такой как фосфат натрия, для контроля pH. Буферы служат нескольким целям: контролируют рН, нейтрализуют заряд на поверхности кремнезема неподвижной фазы и действуют в качестве ионных спаривающих агентов для нейтрализации заряда аналита. Формиат аммония обычно добавляют в масс-спектрометрию для улучшения обнаружения определенных аналитов путем образования аддуктов аналит-аммоний. Летучая органическая кислота, такая как уксусная кислота или чаще всего муравьиная кислота, часто добавляется в подвижную фазу, если масс-спектрометрия используется для анализа стоков колонки. Трифторуксусная кислота редко используется в применениях масс-спектрометрии из-за ее стойкости в детекторе и системе доставки растворителя, но может быть эффективной для улучшения удерживания аналитов, таких как карбоновые кислоты, в применениях, использующих другие детекторы, поскольку это довольно сильная органическая кислота. Эффекты кислот и буферов варьируются в зависимости от применения, но обычно улучшают хроматографическое разрешение. Колонки с обращенной фазой довольно трудно повредить по сравнению с обычными колонками с диоксидом кремния; однако многие колонки с обращенной фазой состоят из частиц диоксида кремния, дериватизированных алкилом, и никогда не должны использоваться с водными основаниями, так как они разрушат нижележащие частицы диоксида кремния. Их можно использовать с водной кислотой, но колонка не должна слишком долго подвергаться воздействию кислоты, поскольку она может разъедать металлические части оборудования ВЭЖХ. Колонки RP-HPLC следует промыть чистым растворителем после использования для удаления остаточных кислот или буферов и хранить в соответствующем составе растворителя.
Содержание металла в колонках ВЭЖХ должно поддерживаться на низком уровне, если необходимо сохранить наилучшую возможную способность к разделению веществ. Хорошим тестом на содержание металла в колонке является введение образца, представляющего собой смесь 2,2′- и 4,4′-бипиридина. Эксклюзионная хроматография по размеру Эксклюзионная хроматография по размеру (SEC), также называемая гель-проникающей хроматографией или гель-фильтрационной хроматографией, разделяет частицы на основе молекулярного размера (фактически по радиусу Стокса частицы). Обычно это хроматография низкого разрешения, и поэтому она часто используется для конечной «полирующей» фазы очистки. Он также используется для определения третичной структуры и четвертичной структуры очищенных белков. SEC широко используется для анализа больших молекул, таких как белки или полимеры. SEC удерживает эти меньшие молекулы в порах частицы. Более крупные молекулы проходят мимо пор, так как они слишком велики, чтобы войти в поры. Более крупные молекулы протекают через колонку быстрее, чем более мелкие молекулы, т.е. чем меньше молекула, тем дольше время удержания. Этот метод обычно используется для определения молекулярной массы полисахаридов. SEC является официальным методом (предложенным Европейской Фармакопеей) для сравнения молекулярной массы различных коммерчески доступных низкомолекулярных гепаринов.
Ионообменная хроматография
Подробнее об этой теме см. Ионообменная хроматография. В ионообменной хроматографии (IC) удержание основано на притяжении между растворенными ионами и заряженными центрами, связанными с неподвижной фазой. Растворенные ионы с тем же зарядом, что и заряженные центры на колонке, исключаются из связывания, в то время как растворенные ионы с противоположным зарядом от заряженных центров колонки остаются на колонке. Ионы растворенного вещества, которые удерживаются на колонке, можно вымывать из колонки путем замены растворителя …
Полимеры представляют собой большие молекулы и имеют одну и ту же структурную единицу, повторяющуюся снова и снова, и эти повторяющиеся единицы известны как мономеры. Эти
Пероксидазы – это оксидоредуктазы, созданные рядом растений и микроорганизмов. Уменьшение количества пероксидаз в непосредственной близости от субстрата, дающего электроны, делает пероксидазы ценными в многочисленных бизнес-приложениях.
Размер первичных частиц ND, полученных методом детонации, хорошо подходит для биомедицинских исследований, продукты детонации должны быть тщательно очищены. В зависимости от материалов и матриц, присутствующих