Сочинение на тему Раннее развитие и определение судьбы Т-клеток у рыбок данио

АННОТАЦИЯ:

Т-лимфоциты являются ключевыми компонентами адаптивной иммунной системы и играют центральную роль в клеточном иммунитете. Хотя было выявлено много подмножеств Т-лимфоцитов и охарактеризованы их функции, раннее развитие и определение судьбы Т-лимфоцитов остаются неясными. Основываясь на том факте, что иммунитет данио и позвоночных имеет много общих аспектов (Renshaw and Trede, 2011), мы выбрали данио в качестве экспериментальной модели для изучения развития Т-лимфоцитов. Как указывалось ранее, первая волна Т-клеток – это все CD4 + клетки (Tian et al., 2017), нам интересно узнать, почему CD8 + Т-клетки не могут генерироваться в первой волне и существуют ли различия между эмбриональными и взрослыми Т-клетками определение судьбы у рыбок данио.

Введение:

Гематопоэз – процесс, посредством которого образуются гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и, следовательно, образуются клетки крови, является важным процессом в развитии эмбрионов. Исследования на мышах и телеостах показали, что кроветворение состоит из нескольких волн из разных источников (Waas and Maillard, 2017). Как правило, первая волна продуцирует эмбриональные эритроциты и макрофаги (Palis et al., 1999), вторая волна приводит к появлению эритромиелоидных предшественников, а третья волна генерирует HSC. Большинство лимфоцитов образуются после третьей волны кроветворения.

Т-лимфоциты являются ключевыми компонентами адаптивной иммунной системы и играют центральную роль в клеточном иммунитете (Pancer and Cooper, 2006). Наиболее распространенными подгруппами Т-клеток являются хелперные Т-клетки и клеточные токсичные Т-клетки, которые экспрессируют ген корецептора CD4 и CD8 соответственно. CD4 и CD8 представляют собой молекулы клеточной поверхности, которые, как полагают, работают путем образования корецептора с рецептором T-клетки (TCR) для распознавания MHC. Обычно считается, что у взрослых млекопитающих Т-клетки CD4 + и CD8 + получают из предшественников CD4 + 8 + путем специфического взаимодействия TCR с главным комплексом гистосовместимости тимуса. Этот вывод основан на экспериментах, проведенных на трансгенных мышах (Teh et al., 1988). Однако на ранних стадиях развития CD4 + и CD8 + Т-клетки, по-видимому, независимы. Хотя известно, что первая волна CD4 + T-клеток возникает из аорты-гонады-мезонефроса (AGM) и желточного мешка (YS) у мышей и из AGM и заднего кровяного острова (PBI) у рыбок данио (Nishikawa et al., 1998; Tian et al., 2017). Остается неясным, где и когда первая волна CD8 + T-клеток возникает у млекопитающих и костистых рыб. Если эта проблема будет решена, у нас будет лучшее понимание развития Т-клеток, и у нас может быть больше методов для лечения заболеваний, вызванных дефицитом иммунитета.

В последнее время рыбка данио (Danio rerio) широко используется в качестве модельной системы для изучения гематопоэтического развития человека. Это основано на том факте, что гематопоэтические программы в основном сохраняются между млекопитающими и рыбками данио (Zon, 1995). Кроме того, биология рыбок данио обеспечивает доступ ко всем стадиям развития и обеспечивает удобство для получения изображений иммунных клеток с высоким разрешением in vivo (Dee et al., 2016). Кроме того, как и млекопитающие, рыбки данио продуцируют множество классов подгрупп T-клеток (включая αβ и γδ T-клетки) и продуцируют аналогичные зрелые клетки крови. Поэтому рыбка данио служит идеальной моделью позвоночных для изучения онтогенеза различных волн Т-лимфоцитов.

В этом исследовании мы используем трансгенную линию рыбок данио в сочетании с покадровой визуализацией и инфракрасно-опосредованной пространственно-временной маркировкой клеток, чтобы проследить Т-клетки CD8 + и попытаться лучше понять развитие Т-клеток. Для создания трансгенных рыбок данио мы используем бактериальную искусственную хромосому (BAC), содержащую репортерный ген, и используем метод опосредованного транспозоном, предоставленный другими (Suster et al., 2011), для интеграции репортерного гена в геном рыбок данио. ВАС широко используются в трансгенезе, поскольку они могут содержать геномные фрагменты размером до 300 т.п.н., которые часто содержат полную структуру гена (Monaco and Larin, 1994). В сочетании с элементом транспозона Tol2 обычно можно получить интеграцию в единственном экземпляре, что означает, что он может выявить реальный уровень экспрессии целевого гена (Chandler et al., 2007). Таким образом, наше исследование не только покажет детали развития, но также выявит уровень экспрессии родственных генов в Т-клетках.

РЕЗУЛЬТАТЫ (НАМЕРЕННЫЙ ПРОГРЕСС):

Поскольку исследование в настоящее время продолжается, мы еще не завершили создание трансгенных линий. После завершения линии Tg (CD8: mCherry; CD4: eGFP) мы сначала проверим, когда CD8 + T-клетки впервые появляются из тимуса. Затем, что более важно, мы проверим, есть ли незрелые Т-клетки, ко-экспрессирующие CD4 и CD8. Если это так, то весьма вероятно, что определение судьбы Т-клеток у телеоста сходно с таковым у млекопитающих (Teh et al., 1988). Таким образом, разница между первой волной и взрослыми Т-клетками (первая волна породила только клетки CD4 +) может быть связана с тем, что: 1. Тимус плода не очень хорошо развит, то есть испытывает недостаток в некоторых видах антигена; 2. Судьба первой волны Т-клеток была определена гораздо раньше; 3. Примитивные макрофаги в тимусе функционально отличаются от зрелых макрофагов. Для условия 1 мы могли бы пометить некоторые родственные гены MHC и гены-хоминг Т-клеток (CCR9a / b) или ввести некоторые антитела для анализа, может ли определение судьбы ранних Т-клеток быть изменено материалами, связанными с тимусом. Для условия 3 мы должны пометить как макрофаги, так и Т-клетки и сосредоточиться на их контакте и связи в тимусе, сравнить его с условиями у взрослых рыб, чтобы убедиться, есть ли какая-либо разница между связью макрофаг-Т-клеток. Для условия 2, может быть, мы можем извлечь Т-клетки плода и культивировать их in vitro или у взрослых рыбок данио, это будет много работы.

Более того, если у взрослой рыбы нет клеток, ко-экспрессирующих CD4 и CD8, мы можем заключить, что определение судьбы Т-клеток у рыбок данио весьма вероятно отличается от определения у млекопитающих. Тогда мы можем сосредоточиться не только на более ранних волнах Т-клеток, но и на всех деталях развития Т-лимфоцитов у рыбок данио. Можно также сделать вывод, что определение судьбы Т-клеток не сохраняется у млекопитающих и телеост. Затем, чтобы прояснить механизм, лежащий в основе определения судьбы Т-клеток Телеоста, возможно, мы обратим внимание на гены, регулирующие экспрессию молекул МНС или регулирующие возвращение Т-клеток (такие как гены класса CCL). Какой метод использовать, зависит от результатов эксперимента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:

данио

Все рыбки данио содержались в соответствии со стандартным протоколом (Wester eld, 2000). В этом исследовании линии рыбок данио Tg (CD8: loxp-IFP-loxp-eGFP), Tg (lck: loxp-IFP-loxp-DsRed), Tg (CD4: mCherry), Tg (CD8: eGFP), Tg (lck: Использовали NTRO-eGFP), Tg (lck: eGFP) и Tg (hsp70: mCherry-T2a-CreERT2). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Фонда по уходу за животными и растениями Гонконгского университета науки и техники (HKUST) и были одобрены Комитетом по этике животных HKUST.

Генерация BAC