Раннее развитие и определение судьбы Т-клеток у рыбок данио сочинение пример

ООО "Сочинения-Про"

Ежедневно 8:00–20:00

Санкт-Петербург

Ленинский проспект, 140Ж

Сочинение на тему Раннее развитие и определение судьбы Т-клеток у рыбок данио

АННОТАЦИЯ:

Т-лимфоциты являются ключевыми компонентами адаптивной иммунной системы и играют центральную роль в клеточном иммунитете. Хотя было выявлено много подмножеств Т-лимфоцитов и охарактеризованы их функции, раннее развитие и определение судьбы Т-лимфоцитов остаются неясными. Основываясь на том факте, что иммунитет данио и позвоночных имеет много общих аспектов (Renshaw and Trede, 2011), мы выбрали данио в качестве экспериментальной модели для изучения развития Т-лимфоцитов. Как указывалось ранее, первая волна Т-клеток – это все CD4 + клетки (Tian et al., 2017), нам интересно узнать, почему CD8 + Т-клетки не могут генерироваться в первой волне и существуют ли различия между эмбриональными и взрослыми Т-клетками определение судьбы у рыбок данио.

Введение:

Гематопоэз – процесс, посредством которого образуются гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и, следовательно, образуются клетки крови, является важным процессом в развитии эмбрионов. Исследования на мышах и телеостах показали, что кроветворение состоит из нескольких волн из разных источников (Waas and Maillard, 2017). Как правило, первая волна продуцирует эмбриональные эритроциты и макрофаги (Palis et al., 1999), вторая волна приводит к появлению эритромиелоидных предшественников, а третья волна генерирует HSC. Большинство лимфоцитов образуются после третьей волны кроветворения.

Т-лимфоциты являются ключевыми компонентами адаптивной иммунной системы и играют центральную роль в клеточном иммунитете (Pancer and Cooper, 2006). Наиболее распространенными подгруппами Т-клеток являются хелперные Т-клетки и клеточные токсичные Т-клетки, которые экспрессируют ген корецептора CD4 и CD8 соответственно. CD4 и CD8 представляют собой молекулы клеточной поверхности, которые, как полагают, работают путем образования корецептора с рецептором T-клетки (TCR) для распознавания MHC. Обычно считается, что у взрослых млекопитающих Т-клетки CD4 + и CD8 + получают из предшественников CD4 + 8 + путем специфического взаимодействия TCR с главным комплексом гистосовместимости тимуса. Этот вывод основан на экспериментах, проведенных на трансгенных мышах (Teh et al., 1988). Однако на ранних стадиях развития CD4 + и CD8 + Т-клетки, по-видимому, независимы. Хотя известно, что первая волна CD4 + T-клеток возникает из аорты-гонады-мезонефроса (AGM) и желточного мешка (YS) у мышей и из AGM и заднего кровяного острова (PBI) у рыбок данио (Nishikawa et al., 1998; Tian et al., 2017). Остается неясным, где и когда первая волна CD8 + T-клеток возникает у млекопитающих и костистых рыб. Если эта проблема будет решена, у нас будет лучшее понимание развития Т-клеток, и у нас может быть больше методов для лечения заболеваний, вызванных дефицитом иммунитета.

В последнее время рыбка данио (Danio rerio) широко используется в качестве модельной системы для изучения гематопоэтического развития человека. Это основано на том факте, что гематопоэтические программы в основном сохраняются между млекопитающими и рыбками данио (Zon, 1995). Кроме того, биология рыбок данио обеспечивает доступ ко всем стадиям развития и обеспечивает удобство для получения изображений иммунных клеток с высоким разрешением in vivo (Dee et al., 2016). Кроме того, как и млекопитающие, рыбки данио продуцируют множество классов подгрупп T-клеток (включая αβ и γδ T-клетки) и продуцируют аналогичные зрелые клетки крови. Поэтому рыбка данио служит идеальной моделью позвоночных для изучения онтогенеза различных волн Т-лимфоцитов.

В этом исследовании мы используем трансгенную линию рыбок данио в сочетании с покадровой визуализацией и инфракрасно-опосредованной пространственно-временной маркировкой клеток, чтобы проследить Т-клетки CD8 + и попытаться лучше понять развитие Т-клеток. Для создания трансгенных рыбок данио мы используем бактериальную искусственную хромосому (BAC), содержащую репортерный ген, и используем метод опосредованного транспозоном, предоставленный другими (Suster et al., 2011), для интеграции репортерного гена в геном рыбок данио. ВАС широко используются в трансгенезе, поскольку они могут содержать геномные фрагменты размером до 300 т.п.н., которые часто содержат полную структуру гена (Monaco and Larin, 1994). В сочетании с элементом транспозона Tol2 обычно можно получить интеграцию в единственном экземпляре, что означает, что он может выявить реальный уровень экспрессии целевого гена (Chandler et al., 2007). Таким образом, наше исследование не только покажет детали развития, но также выявит уровень экспрессии родственных генов в Т-клетках.

РЕЗУЛЬТАТЫ (НАМЕРЕННЫЙ ПРОГРЕСС):

Поскольку исследование в настоящее время продолжается, мы еще не завершили создание трансгенных линий. После завершения линии Tg (CD8: mCherry; CD4: eGFP) мы сначала проверим, когда CD8 + T-клетки впервые появляются из тимуса. Затем, что более важно, мы проверим, есть ли незрелые Т-клетки, ко-экспрессирующие CD4 и CD8. Если это так, то весьма вероятно, что определение судьбы Т-клеток у телеоста сходно с таковым у млекопитающих (Teh et al., 1988). Таким образом, разница между первой волной и взрослыми Т-клетками (первая волна породила только клетки CD4 +) может быть связана с тем, что: 1. Тимус плода не очень хорошо развит, то есть испытывает недостаток в некоторых видах антигена; 2. Судьба первой волны Т-клеток была определена гораздо раньше; 3. Примитивные макрофаги в тимусе функционально отличаются от зрелых макрофагов. Для условия 1 мы могли бы пометить некоторые родственные гены MHC и гены-хоминг Т-клеток (CCR9a / b) или ввести некоторые антитела для анализа, может ли определение судьбы ранних Т-клеток быть изменено материалами, связанными с тимусом. Для условия 3 мы должны пометить как макрофаги, так и Т-клетки и сосредоточиться на их контакте и связи в тимусе, сравнить его с условиями у взрослых рыб, чтобы убедиться, есть ли какая-либо разница между связью макрофаг-Т-клеток. Для условия 2, может быть, мы можем извлечь Т-клетки плода и культивировать их in vitro или у взрослых рыбок данио, это будет много работы.

Более того, если у взрослой рыбы нет клеток, ко-экспрессирующих CD4 и CD8, мы можем заключить, что определение судьбы Т-клеток у рыбок данио весьма вероятно отличается от определения у млекопитающих. Тогда мы можем сосредоточиться не только на более ранних волнах Т-клеток, но и на всех деталях развития Т-лимфоцитов у рыбок данио. Можно также сделать вывод, что определение судьбы Т-клеток не сохраняется у млекопитающих и телеост. Затем, чтобы прояснить механизм, лежащий в основе определения судьбы Т-клеток Телеоста, возможно, мы обратим внимание на гены, регулирующие экспрессию молекул МНС или регулирующие возвращение Т-клеток (такие как гены класса CCL). Какой метод использовать, зависит от результатов эксперимента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:

данио

Все рыбки данио содержались в соответствии со стандартным протоколом (Wester eld, 2000). В этом исследовании линии рыбок данио Tg (CD8: loxp-IFP-loxp-eGFP), Tg (lck: loxp-IFP-loxp-DsRed), Tg (CD4: mCherry), Tg (CD8: eGFP), Tg (lck: Использовали NTRO-eGFP), Tg (lck: eGFP) и Tg (hsp70: mCherry-T2a-CreERT2). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Фонда по уходу за животными и растениями Гонконгского университета науки и техники (HKUST) и были одобрены Комитетом по этике животных HKUST.

Генерация BAC

Все BAC генерируются в соответствии с методом Максимилиано Л. Сустера (Suster et al., 2011). Принимая BAC (lck: eGFP) в качестве примера, клон lck BAC (CH211-230I4) был приобретен через ZFIN. Для создания BAC, используемого для генерации Tg (lck: eGFP), мы сначала подготовили кассету eGFP с помощью ПЦР. Чтобы создать вектор рекомбинации экзона 1, два гомологичных плеча также амплифицировали с помощью ПЦР. Используются следующие праймеры: левый HA FP: 5′-ATTGGGTACCGGGCCCCCCCAATTGTTAGCAGAGTATCTGTCG-3 ‘, левый HA RP: 5′- CCCTTGCTCACCATGGTGGCTTTTTCCAGTTTCCAGCACAAGCAT-3′, справа HATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG CGGTGGCGGCCGCTCTAGAAACAATTAACTTCTACGGTGCT-3’ . Длина левой и правой гомологичной руки составляет 658 б.п. и 548 б.п. соответственно. Поскольку существует неспецифическое связывание (рис. 1), мы разрезали гель и экстрагировали ДНК, используя набор для экстракции геля OMEGA. После сбора всех продуктов ПЦР мы связали левую и правую HA, репортерную кассету и плазмиду pBluescript SK (PBSK) вместе, используя сборку Гибсона в соответствии со стандартным протоколом (Perkel, 2014). Собранную плазмиду затем вводили в компетентные клетки E.coli для отбора.

Правильно собранная плазмида PBSK была отобрана с помощью ПЦР колонии, использовались следующие праймеры: M13 FP: 5’- GTAAACGACGGCCAGT-3 ’и M13 RP: 5’- GTCATAGCTGTTTCCTG-3’ (рисунок 2). Чтобы вставить целевую кассету посредством гомологичной рекомбинации, вектор pSIM, который содержит функции индуцируемой теплом рекомбиназы, электропорировали в клетки, которые содержат ВАС. Эти бактерии поддерживали при 32 ° С в течение 24 часов. После этого клетки подвергали тепловому шоку при 42 ° С в течение 15 минут и трансформировали в компетентные клетки в соответствии с протоколом химической трансформации, предоставленным другими (Suster et al., 2011). Затем клетки смешивали с кассетой iTol2 для конструирования BAC, содержащих ген транспозона iTol2. Кассету репортерного гена вставляли в основную цепь BAC таким же способом. Конечные BAC были извлечены, и клетки, содержащие конечный BAC, были выращены для дальнейшего использования.

Генерация трансгенных линий

ДНК ВАС очищали и инъецировали в эмбрионы рыбок данио на одноклеточной стадии вместе с мРНК Tol2, которая была синтезирована ранее. Через десять часов после микроинъекции в каждой группе было случайным образом отобрано 8 эмбрионов, чтобы подтвердить удаление Tol2-опосредованной вставки BAC у инъецированных эмбрионов (Figure3). Если инъекция будет подтверждена, оставшиеся эмбрионы будут выращены до зрелого возраста. Для выполнения инфракрасно-опосредованной пространственно-временной маркировки клеток линию данио рерио Tg (lck: loxp-IFP-loxp-Dsred) скрещивали с линией Tg (hsp70: mCherry-T2a-CreERT2), а затем дополнительно скрещивали с Tg (lck: NTRO = eGFP) для генерации эмбрионов Tg (hsp70: mCherry-T2a-CreERT2; lck: loxp-IFP-loxp-eGFP; lck: NTRO-eGFP). Эти эмбрионы используются для изучения восстановления локализованных в тимусе Т-клеток. Чтобы идентифицировать различные пути развития CD4 + T-клеток и CD8 + T-клеток, Tg (CD4: mcherry) и Tg (CD8: eGFP) скрещивали для генерации линии Tg (CD4: mCherry; CD8: eGFP).

Инфракрасно-опосредованная пространственно-временная маркировка клеток

Инфракрасно-опосредованная пространственно-временная система маркировки клеток была установлена ​​в соответствии с предыдущим исследованием (Xu et al., 2015). Мощность 1345 нм света на поверхности образца составляет около 65-80 мВт, а время каждого удара составляет примерно 2 минуты. Использовали линию рыбок данио Tg (hsp70: mCherry-T2a-CreERT2; lck: loxp-IFP-loxp-eGFP; lck: NTRO-eGFP). За один день до мечения рыбу обрабатывали метронидазолом (MTZ) для уничтожения всех локализованных в тимусе Т-клеток в соответствии со стандартным протоколом (Mathias et al., 2014). Затем область PBI маркировали, облучая два или три положения вдоль области PBI при 5 dff. Восстановление локализованных в тимусе Т-клеток анализировали с помощью покадровой визуализации или гибридизации in situ. В другом эксперименте линия Tg (CD8: lozp-IFP-loxp-eGFP) была также помечена на PBI, чтобы прояснить, откуда берется первая волна CD8 + T-клеток и способны ли HSC-независимые гематопоэтические предшественники вызывать CD8 + Т-клетки.

Идентификация мутантов

Для выбора рыбы F0 с трансмиссией зародышевой линии сначала наблюдали эмбрионы под флуоресцентным микроскопом, отбирали эмбрионы с более сильным флуоресцентным ответом и доводили их до зрелого возраста. Затем рыбу пересекали по линии дикого типа (ABS), и считается, что те, кто может производить потомство с флуоресцентными сигналами, имеют стабильную интеграцию зародышевой линии (Suster et al., 2011).

Гибридизация in-mount целиком

Антисмысловой DIG-меченный РНК-зонд был синтезирован in vitro с использованием специально разработанных ДНК. Рыбу обезвоживали и фиксировали в 4% PFA при комнатной температуре. Процесс окрашивания был в соответствии с предыдущим исследованием (Тиссе и Тиссе, 2008). Флуоресцентная микроскопия была использована для обнаружения сигналов.

ОБСУЖДЕНИЕ:

Адаптивный иммунитет считается одним из ключевых эволюционных нововведений в появлении позвоночных (Boehm, 2012), которые значительно повысили эффективность иммунной активности. В этом исследовании мы используем рыбок данио в качестве экспериментальной модели, чтобы расширить наше понимание развития и определения судьбы Т-лимфоцитов. Мы попытаемся определить, почему на ранних стадиях развития нет Т-клеток CD8 +, и добавим больше деталей к определению судьбы Т-клеток.

Наше понимание гемопоэза у рыбок данио сильно отстает от нашего уровня знаний о млекопитающих (Dee et al., 2016). Тем не менее, этот разрыв, вероятно, быстро сократится, так как во многих областях исследований данио служит лучшей экспериментальной моделью, чем млекопитающие. Кроме того, достижения в области технологий, таких как трансгенная технология и оптимизация флуоресцентных белков, обеспечили значительное удобство в молекулярном анализе и в отслеживании отдельных клеток. Мы предполагаем, что более великие открытия будут сделаны с использованием рыбок данио, используя его быстрое время генерации, визуализацию отдельных клеток in situ и доступность для генетических манипуляций.

Поделиться сочинением
Ещё сочинения
Нет времени делать работу? Закажите!

Отправляя форму, вы соглашаетесь с политикой конфиденциальности и обработкой ваших персональных данных.