Сочинение на тему Обзор ДНК / РНК и технологии CRISPR / Cas9 для понимания генной инженерии

По мере роста области биотехнологии химики и биологи сталкиваются с постоянно растущей загадкой этических препятствий, вызванных технологическими прорывами. Генная инженерия стоит на пороге революции. Прорыв в технологиях генной инженерии (GE) скоро сделает проще, дешевле и эффективнее, чем когда-либо прежде, изменять ДНК живых организмов. Технология GE используется для изменения ДНК живых организмов и имеет ряд различных применений. Одним из наиболее перспективных применений технологий GE является генная терапия. Генная терапия – это метод, при котором биологи изменяют ДНК живых организмов, пытаясь вылечить генетические заболевания (Gura, 2001). Ранние разногласия по поводу использования генной терапии для лечения заболеваний были вызваны смертью больного гемофилией в исследовании генной терапии (Gura, 2001). Самым большим препятствием, с которым сталкиваются любые новые технологии GE, является неопределенность рисков, связанных с ней. Передовая технология GE на сегодняшний день, CRISPR / Cas9, не является исключением из этого правила. Несмотря на то, что CRISPR / Cas9 призван революционизировать мир генной инженерии, от научного сообщества наблюдается значительный отклик в отношении использования CRISPR / Cas9 и потенциальных побочных эффектов, которые могут быть неосознанно вызваны его использованием (Gilles & Averof, 2014). Краткий обзор ДНК / РНК, а также технологии CRISPR / Cas9 в сочетании с анализом потенциальных недостатков и преимуществ CRISPR / Cas9 позволит читателю лучше понять динамику противоречий и прийти к собственному консенсусу по этому вопросу. .

Чтобы понять механизм CRISPR / Cas9, нужно знать функции и процессы ДНК и РНК в клетке. ДНК, дезоксирибонуклеиновая кислота, является строительным элементом всей жизни. Он состоит из двух цепочек комплементарных нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из фосфатной группы (PO4), дезоксирибозного сахара, организованного в виде кольца 5C (C5H10O4), и азотистого основания (аденин, гуанин, тимин, цитозин). Нуклеотиды ковалентно связаны друг с другом фосфодиэфирной связью, образованной между 5С-сахаром одного нуклеотида и фосфатной группой другого нуклеотида. Две цепи нуклеотидов связаны водородными связями, образованными между комплементарными азотистыми основаниями. Аденин обладает комплементарностью для тимина, тогда как гуанин обладает комплементарностью для цитозина (Thieman & Palladino, 2013). Две цепи нуклеотидов образуют двухцепочечную структуру с двойной спиралью, называемую ДНК. ДНК необходима для функционирования клетки, так как она кодирует все белки, найденные в клетке. Для получения белка ДНК сначала должна быть скопирована другая нуклеиновая кислота, РНК. Затем РНК отправляет копию ДНК на рибосомы в клетке, которая переводит последовательность РНК в аминокислотную цепь с образованием белка (Thieman & Palladino, 2013). Весь процесс транскрипции и трансляции не входит в сферу этой статьи, так как для этого нужно только понять основную функцию ДНК как «кода» для жизни и РНК как транслятора для ДНК. Последовательности ДНК «читаются» как буквы, обозначающие азотистые основания в направлении от 5 простых (5 ‘) до 3 простых (3’). 5 ‘относится к концу последовательности с фосфатной группой, связанной с пятым углеродом сахарной дезоксирибозы. Например, последовательность аденин-тимин-гуанин-цитозин читается как ATGC. Конкретная последовательность ДНК с известной функцией называется геном. Местоположение гена называется его локусом.

Сгруппированные регулярно пересекающиеся короткие палиндромные повторы, или CRISPR, происходят из естественного иммунного ответа бактерий на вирусную инфекцию (Gilles & Averof, 2014). CRISPR относится к локусу или локусам, обнаруженным в геноме бактериальных клеток. Механизм CRISPR включает в себя включение вирусной ДНК в последовательность CRISPR, чтобы позволить бактериям продуцировать цепь РНК, которая комплементарна вирусной ДНК. Это называется «производная от CRISPR РНК (Gilles & Averof, 2014)» или crRNA. КРРНК связывается с «CRISPR-ассоциированными (Cas) белками с образованием активного комплекса CRISPR / Cas с эндонуклеазой (Gilles & Averof, 2014)». Эндонуклеаза – это белок, способный разрушать ДНК. CRISPR / Cas9 относится к специфической эндонуклеазе, продуцируемой бактерией Streptococcus pyogenes. CRISPR / Cas9 содержит две формы РНК и белок Cas9. КРРНК содержит последовательность, необходимую для комплементарного связывания с вирусной ДНК. Другой тип РНК, «транс-действующая антисмысловая РНК, также известная как tracRNA», содержит последовательность, необходимую для «образования комплекса с Cas9 (Gilles & Averof, 2014)». Вместе кРНК и тракРНК образуют «направляющую РНК» комплекса. Последняя часть, Cas9, представляет собой белок, который действует как нуклеаза в комплексе. Механизм CRISPR / Cas9 требует, чтобы в ДНК-мишени присутствовала короткая последовательность нуклеотидов, следующая за последовательностью, на которую нацелена направляющая РНК (гРНК). Эта последовательность, называемая «мотивом смешения протоспейсера» (PAM), требуется для функции Cas9 (Gilles & Averof, 2014).

Комплекс CRISPR / Cas9 был модифицирован учеными, чтобы он содержал любую желаемую последовательность рРНК, которая позволяет нацеливаться на любой ген, который содержит PAM. У бактерий процесс CRISPR заканчивается равномерным расщеплением ДНК, происходящим на несколько нуклеотидов выше PAM. Для бактерий это эффективный метод уничтожения вирусной ДНК. Однако у эукариот CRISPR / Cas9 используется для нацеливания на ген и вставки, удаления или иного изменения этого гена. Инженерные комплексы CRISPR / Cas9 используют два типа механизмов репарации, используемых ДНК (Gilles & Averof, 2014). Первый процесс негомологичного присоединения конца или NHEJ, не требует гомологичной цепи (ДНК, содержащей одинаковые гены с потенциально отличающимися аллелями) ДНК для репарации. В NHEJ срезанные концы ДНК просто воссоединяются, а связи реформируются. NHEJ может привести к удалению последовательностей ДНК или может ввести (вставить) новую ДНК в цепь во время репарации (Reis, Hornblower & Tzertzinis, 2014). Другой механизм репарации, гомологичное восстановление или HDR, требует гомологичной цепи ДНК, чтобы скопировать короткий участок ДНК, используемый для восстановления сломанной цепи. HDR можно использовать путем введения гомологичной ДНК, содержащей мутированную или нормальную форму восстанавливаемого гена. Удаление гена называется нокаутом и обычно осуществляется через NHEJ, а вставка гена называется «нокдауном» и может выполняться NHEJ или HDR (Reis, Hornblower & Tzertzinis, 2014).