Сочинение на тему Молекулярная характеристика гельминтного паразита, обнаруженного в Channa Punctata

В статье представлен систематический обзор паразитов гельминтов, обнаруженных в Channa punctata из пяти районов Западной Бенгалии. Исследование проводилось в период с января 2014 года по март 2017 года и в основном трех видов паразитов Eustrongylides sp. , Euclinostomum heterostomum и Clinostomum complanatum были зарегистрированы. Предоставляются данные об их морфологии и месте заражения. Сканирующее электронное микроскопическое исследование впервые использовалось для таксономического описания этих паразитов, обнаруженных в Западной Бенгалии, что выявило некоторые дополнительные морфологические детали. Все гельминты были кратко описаны и проиллюстрированы. Исследование было проведено на экономически важных рыбах для создания базы данных о различных типах инфекции, вызываемой паразитами гельминтов.

Введение

Заболевания у пресноводных рыб обычно преобладают, поскольку они служат определяющим, промежуточным или паратеническим (транспортным) хозяином в жизненном цикле многих видов паразитов простейших, метазоя и ракообразных. Паразиты влияют на товарность рыбы, выпускаемой в промышленных масштабах, что вызывает проблемы со здоровьем у населения, особенно в районах, где едят сырую или копченую рыбу. Тяжелое заражение паразитами приводит к высокой смертности рыб и экономическим потерям в секторе аквакультуры, тогда как в естественных системах они могут уменьшать численность и разнообразие местных видов рыб.

Паразиты гельминтов, поражающие позвоночных, принадлежат к двум типам – платихельминтам и немательминтам. Плоские черви класса Monogenea являются эктопаразитами на жабрах и коже хозяина, тогда как трематоды (трематоды: Digenea), ленточные черви (Cestoda) и нематоды заражают внутренние органы с их промежуточными стадиями, иногда энцистизирующими в различных тканях хозяина. В общем, эндопаразитарные гельминты имеют гетероксенный жизненный цикл, т.е. е. тот, в котором паразит проходит по крайней мере одну промежуточную стадию, прежде чем перерастет во взрослого. Последняя стадия в некоторых случаях обычно развивается у высших позвоночных, которые питаются рыбой (например, рыбоядными, птицами, млекопитающими, человеком), и в этом случае личиночная стадия у рыб проявляет морфологическую или физиологическую адаптацию, которая позволит им выжить, чтобы достичь взрослой стадии и размножаться. Жизненный цикл большинства паразитов гельминтов настолько сложен, что включает в себя более одного промежуточного хозяина, включая рыб, поэтому их изучение позволяет лучше понять динамику водной системы в целом.

Другие водные животные, такие как планктонные веслоногие ракообразные и моллюски, играют важную роль в развитии паразитического гельминта как промежуточного хозяина. Змееголовая пресноводная рыба, Channa punctata Bloch, 1793 г. из семейства Channidae, имеет широкое географическое распространение, высокие темпы роста и вносит значительный вклад в рыболовный сектор Индии. Он обычно обитает в болотах, бассейнах, рисовых полях и известен своими питательными и бодрящими качествами. Многие работники, такие как Bhalerao (1936, 1942), Dayal (1949), Gupta (1961), внесли значительный вклад в таксономию дигенетических тразатод и паразитов цестод. Рыбные нематоды индийского региона были изучены Карве (1930), Агарвал (1966) и Соота (1983). Данные о заражении паразитами гельминтов рыб в различных районах Западной Бенгалии ограничены. Работа проводилась на экономически важных рыбах, и основной целью было создание базы данных о различных типах инфекции, вызываемой паразитами гельминтов, в результате чего рыбная промышленность сталкивается с серьезными экономическими потерями.

Предыдущее представление было неполным и основывалось на световых микроскопических изображениях, поэтому настоящее исследование было предпринято для идентификации и классификации паразитов гельминтов, заражающих Channa punctata.

Материалы и методы

Сбор образцов рыбы. Рыбы-хозяева длиной 17–21 см и весом 50–75 г были собраны с рыбоводческих хозяйств в пяти районах Западной Бенгалии (Надия, Северная 24 Парагана, Ховра, Хугли и Муршидабад) в период Январь 2014 – март 2017 года и были доставлены в лабораторию паразитологии для обследования. Их держали в течение 3 недель под наблюдением для акклиматизации в стеклянных аквариумах (40 × 60 × 100 см).

Вода менялась после каждых 24 часов, и в течение периода акклиматизации рыба снабжалась рыбным кормом. Мертвая рыба (если таковая имеется) была удалена из аквариума как можно скорее, чтобы избежать загрязнения водой. Сбор и установка паразитов. Рыбы были вскрыты, а полость тела тщательно исследована на наличие паразитов. Висцеральные органы помещали в петриш, содержащий нормальный физиологический раствор (0,6% NaCl), чтобы обеспечить высвобождение прилипших паразитов. Собранные нематоды фиксировали в горячем 70% этаноле после тщательной промывки в физиологическом растворе. Затем нематоды хранили в стеклянных флаконах, содержащих глицериновый спирт (1: 3), и маркировали отдельно для каждой рыбы. Для светового микроскопического исследования каждую нематоду очищали в лактофеноле для морфологического наблюдения и идентификации. Трематоды промывали в солевом растворе и фиксировали между складками стеклянных предметных стекол и покровными стеклами, связанными резиновыми полосами или нитками. AFA или 70% этанол пропускали через предметные стекла и покровные стекла. Затем образцы хранили в банках для сочетания, содержащих 70% этанола и 5% глицерина. Относительные параметры были измерены, и идентификация была выполнена с использованием выбранных идентификационных ключей.

Подготовка образца для сканирующего электронного микроскопа

Паразиты гельминтов собирали с зараженной рыбы и фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида, приготовленном в 0,1 М натриевом какодилатном буфере (рН 7,4) при 4 ° С. Затем образцы постфиксировали в 1% тетраоксиде осмия, обезвоженном через ряд спиртовых марок, с последующей промывкой смесью абсолютного спирта и амилацетата в соотношениях 3: 1, 2: 2 и 1: 3 соответственно и, наконец, в 100% амилацетате. Затем образцы были закреплены на заглушках с двойной клейкой лентой и покрыты золотом с помощью устройства для нанесения покрытия (Quorum Q 150 TES). Образцы с покрытием исследовали на сканирующем электронном микроскопе высокого разрешения (Zeiss EVO-MA 10, Германия), работающем при ускоряющих напряжениях 15 кВ.

Осаждение образцов

Образцы паразитов (Paratypes) были сданы на хранение в лабораторию паразитологии, отделение зоологии, Университет Каляни, Каляни в Западной Бенгалии, Индия. Генотипическая характеристика: идентифицированные образцы паразитов были дополнительно подтверждены современной молекулярной техникой, такой как анализ 18S рДНК, ITS1, 5,8S рРНК, ITS2 и 28S рРНК. Анализ включает в себя выделение, амплификацию и секвенирование гена, кодирующего 18S рРНК, ITS1, 5,8S рРНК, ITS2 и 28S рРНК (Bangalore Genei и Eurofins Bangalore).

Выделение и анализ геномной ДНК

Нематодную и трематодную ДНК выделяли с использованием набора для выделения геномной ДНК в соответствии с инструкциями производителя (Bangalore Genei и Eurofins). ПЦР-амплификация и секвенирование в случае Eustrongylides sp. Последовательности рДНК фрагмента гена ITS1, 5. 8S рРНК и гена ITS2 амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

электрофорез в агарозном геле

Продукты ПЦР (10 мл) разделяли электрофорезом в 1,0% агарозном геле, содержащем бромид этидия (0,5 мг / мл), при 100 В в течение 1 часа в 1X TBE (трис-борная кислота-EDTA). буфера. Ампликоны отрезают от геля и очищают с использованием набора для очистки ПЦР, элюированного трис-HCl (10 мМ, рН 8,5), перед секвенированием. Секвенирование и филогенетический анализ в случае Eustrongylides sp. последовательности почти полной длины амплифицированных генов рДНК (1090 п.н.) были получены с помощью автоматического секвенатора. Последовательности редактировали с использованием программного обеспечения Clustal X mega, и в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) выполнялся поиск BLAST для определения ближайшего соседа амплифицированной последовательности. Результаты секвенирования были использованы для поиска гомологии.

В случае Euclinostomum sp. Реакцию прямого и обратного секвенирования ДНК ампликона ПЦР проводили с праймерами 28SF и 28SR с использованием BDT v3.1. Набор для секвенирования циклов на ABI 3730xl Genetic Analyzer. Консенсусная последовательность ампликона ПЦР была получена из данных прямой и обратной последовательности с использованием программного обеспечения для выравнивания. Последовательность области 28S рДНК Euclinostomum sp. был выровнен с использованием программного обеспечения множественного выравнивания Clustal W, матрица расстояний была сгенерирована, и филогенетическое дерево было построено с использованием MEGA 7. Филогенетические деревья были выведены с использованием метода соединения соседей.

Результаты и обсуждение

Макроскопическое и микроскопическое наблюдение