Выделение ДНК является очень важной техникой, которая является основой для многих типов техник, таких как диагностика многих генетических заболеваний, а также ДНК для снятия отпечатков пальцев. Какое количество и чистота требуются, тип ДНК – это то, что имеет значение для различных методов выделения ДНК. Существовали три разные культуры кишечной палочки, целью которых был анализ ДНК кишечной палочки.
Для манипулирования и выделения ДНК из кишечной палочки было использовано несколько методов. Мы начнем с выделения плазмидной ДНК из 3 культур с использованием щелочного лизиса. Щелочной лизис – это метод экстракции, используемый для выделения плазмидной ДНК из бактерий. Затем ДНК, которая была выделена рестриктазой, используется для расщепления. Ферменты рестрикции способны расщеплять ДНК и превращать их в фрагменты, и это находится внутри молекулы в сайтах, называемых сайтами рестрикции. Бактериальная трансформация была также сделана. Наконец, анализ E. coli, который трансформируется, и это достигается с помощью электрофореза в агарозном геле.
Метод
Практическая 1
Были предоставлены три культуры E.coli A, B и C, которые выращивали в течение ночи при встряхивании при 37 ° C. Бактериальный осадок растворяют в 100 мл раствора 1. Раствор 1 содержит 50 Мм глюкозы, глюкоза стремится обеспечить осмотический баланс между клеткой и раствором, и это предотвращает разрыв клеток на этой стадии. Раствор 1 также содержит 25 мм трис (рН 8,0), который используется для стабилизации рН в растворе. EDTA 10Mm также является химическим веществом, которое необходимо для ферментов, разрушающих ДНК. Основной целью ЭДТА является связывание с магнием и кальцием, что останавливает деградацию ДНК. ЭДТА также способна стабилизировать фосфатный остов ДНК, а также клеточную стенку.
Добавляют следующий раствор II, раствор II представляет собой 0,2 М NaOH и 1% (вес / объем) SDS. Этот сильный щелочной раствор способен нарушать клеточные мембраны и позволяет контактировать и денатурировать плазмиду и хромосомную ДНК. Содержимое клеток вступало в контакт с внеклеточными химическими веществами, что позволяло ЭДТА хелатироваться с ионами металлов в клетках. SDS осаждается с белками в содержимом клетки и образует нерастворимый комплекс. В результате в растворе наблюдались осадки. Хромосомная ДНК и плазмидная ДНК были денатурированы высоким pH в растворе. Процесс известен как денатурация, так как он
Затем добавляют раствор 3, который представляет собой 3М ацетат калия, рН 4,8. Ацетат калия способен снижать щелочность раствора, поэтому он способен ренатурировать плазмидную ДНК, но не ренатурировать хромосомную ДНК. SsDNA может реорганизовать dsDNA, потому что водородные связи между одноцепочечной ДНК восстанавливаются. Благодаря гидрофобным связям белый осадок образуется SDS, денатурированными клеточными белками и одноцепочечной геномной ДНК, все они слипаются, тогда как двухцепочечная плазмида растворяется в растворе.
В этот момент большая часть клеточного дебриса отделяется от плазмидной ДНК, но в растворе присутствуют остатки солей, РНКазы и ЭДТА, поэтому раствор должен быть очищен и плазмидная ДНК сконцентрирована. Затем добавляют 70% этанола, и он способен изменять структуру ДНК по мере их агрегации и осаждения из раствора. С помощью центрифугирования осажденная ДНК может быть отделена.
Практическая часть 2
Из E.coli, которая была выделена рядом, мы начинаем разрушать ДНК с помощью рестрикционных нуклеаз. Ферменты рестрикции разрезают молекулы ДНК в определенных областях, чтобы разрезать их на более мелкие фрагменты. Различные виды последовательностей ДНК обрезаются и распознаются различными рестриктазами. Эти рестриктазы также нуждаются в буфере, который подходит, включая магний в качестве кофактора. Определенная концентрация и Трис для буферизации тел. Для разных видов ферментов существуют разные оптимальные концентрации соли. Образцы B и C выделяют с помощью 10 единиц фермента.
Есть 2 трубки, которые называются трубкой BR и трубкой CR. Пробирка BR содержит ДНК B, 10-кратный буфер EcoR1, фермент EcoR1 и воду, пробирка CR содержит то же самое, но вместо ДНК B она содержит ДНК C. Существует определенный порядок, в котором они добавляются. Сначала добавляется вода, затем это буфер, ДНК и, наконец, фермент. Причина этого порядка в том, что перед добавлением фермента необходимо создать подходящую среду. Eco R1 в основном представляет собой рестриктазу, выделенную из E.coli, которая в определенных местах разрезает двойную спираль ДНК в определенном сайте рестрикции. EcoR1 может делать разрезы в основной цепи обеих цепей, и это позволяет иметь два липких конца в месте разреза ДНК.
Существует определенная последовательность, которую EcoR1 может распознать, это последовательность GAATTC, и фермент врезается между G и A на цепи, которая является комплементарной. Для начала раствор добавляют по порядку с водой, буфером и ферментом. Вода используется для разбавления буфера, потому что производитель концентрирует буфер. Здесь присутствует буфер EcoR1, поскольку он является оптимальным буфером, используемым для эффективности фермента. Когда условия наконец подходят для фермента, его добавляют. Это когда он открывает или фрагментирует плазмидную ДНК. Как только обе пробирки были закончены, их инкубировали.
Трансформация плазмиды
В настоящее время используется метод, известный как бактериальная трансформация, и две пробирки B и B разводятся в трис-буфере при pH 7,6, что составляет 40 крат конечного объема смеси, так как они разбавлены, они помечены как разбавленные Б и разбавленный БР. Целью бактериальной трансформации является введение ДНК в бактериальные клетки. Есть много методов, используемых для достижения этой цели, но надежный метод – это метод теплового шока. Когда ДНК занята, она должна либо присоединиться к геному хозяина, либо автономно размножаться. Циркулярные формы ДНК – единственная ДНК, которая сможет реплицироваться, линейная форма, использующая ферменты рестрикции, не сможет трансформироваться. Круглая форма при введении в E. coli сможет размножаться.
В методе теплового шока используется хлорид кальция, который создает среду с высоким содержанием кальция, между плазмидной ДНК и бактериальной клеточной мембраной среда с высоким содержанием кальция нейтрализует электростатическое отталкивание между ними. В бактериальных порах создаются поры, поскольку произошло внезапное повышение температуры, что позволяет проникать плазмидной ДНК в бактериальную клетку. Когда клетка захватывает ДНК, она устанавливает себя, чтобы создать устойчивый трансформант. На практике неизвестный штамм клеток E.coli добавляли с хлоридом кальция и предварительно охлаждали на льду. Процедуру повторяют дважды и держат на льду. Одновременно готовят пробирку 1, которая не содержит плазмидную ДНК, готовят пробирку 2, содержащую разведенную плазмиду B, и пробирку 3, содержащую разведенную плазмиду BR.
Предварительно охлажденные компетентные клетки добавляли в пробирки 1, 2 и 3 и осторожно перемешивали. Поскольку клетки являются хрупкими, важно избегать использования вихря. Через 15 минут пробирки встряхивали горячей водой при 42 ° С. На этой стадии клеточная мембрана становится тоньше, и плазмидная ДНК может проникать в клеточный организм. Через 2 минуты пробирки помещали на лед на 5 минут, чтобы дать клеточной мембране восстановиться. L бульон добавляют в каждую пробирку и воду омывают при 37 ° С в течение не менее 20 минут. После этого клетки в каждую пробирку переносили в планшет с LB-амперой и инкубировали в течение ночи.
Практическая 3
Электрофорез в агарозном геле является широко распространенным методом анализа размера, чистоты, количества и последовательности молекул ДНК и молекул плазмидной ДНК. Агароза представляет собой полисахарид, является одним из компонентов агара и извлекается из красных водорослей. Это также составлено из единиц безводной галактозы. Есть много причин, почему агарозный гель полезен для гель-электрофореза. Между полисахаридным звеном агарового геля образуются нековалентные связи. Состояние золя образуется, когда нековалентные связи удерживают структуру агарозного геля, поэтому он претерпевает фазовый переход при высокой температуре. Когда рабочий буфер и порошок агарозы смешиваются, он создает гель с более поздним расположением состояния золя при более высокая температура, а также организовано охлаждение.
Для начала агарозный гель готовят расплавленной агарозой, наливаемой в первую. В образце ДНК образуются лунки для загрузки ДНК расческами, после чего их оставляют на отстаивание примерно на 20 минут. После того, как гель был установлен, буфер TBE используется для переноса тока и обеспечения ионов, он также может поддерживать Ph. Как мы знаем, ДНК заряжена отрицательно, поэтому, когда электрическое поле прикладывается в течение периода электрофореза, будет движение ДНК к аноду, который является положительным полюсом. Лунки для загрузки образца должны быть направлены к отрицательному полюсу, который является катодом, поэтому, когда гель помещается в емкость для электрофореза, он ориентируется.
Загрузочный буферный раствор используется для обработки образца плазмиды до его загрузки в гель. Плотность образца увеличивается, так как загрузочный буфер содержит глицерин. ДНК способна перемещаться к положительному электроду, поскольку более крупные фрагменты замедляются по сравнению с более мелкими фрагментами, поэтому они не перемещаются далеко. Полоса также формируется, когда все фрагменты собираются в одной точке и движутся с более или менее одинаковой скоростью. Итак, теперь, когда все фрагменты прошли и разделили фрагменты разных размеров, появляется краситель, известный как SYBER-SAFE, и он используется для визуализации ДНК. Когда краситель подвергается воздействию ультрафиолетового излучения, возникает флуоресцентный свет оранжевого цвета. Наконец, ультрафиолетовое транс-освещение фотографирует гель, который содержит окрашенные молекулы ДНК. Загрузочный буфер завершает цикл, а также уравновешивает pH в геле.
Результаты
Трансформированные кишечные палочки из пробирок 1, 2 и 3 выращивали на чашке с агаром. Пробирка содержала 0 колоний, пробирка 2 содержала 300 колоний, а пробирка 3 содержала 5 колоний. Трубка 1 содержала 0 колоний, поскольку содержала только буфер. Пробирка 2 содержала 300 колоний, поскольку содержала кольцевую плазмидную ДНК. Пробирка 3 содержала только 5 колоний, поскольку она содержала только линейную ДНК, поэтому единственным способом, которым она могла содержать колонии, могло быть загрязнение или мутация. Из результатов показывает, что пробирка С не продвинулась далеко, поскольку молекулы были большими или имели низкий молекулярный заряд, поэтому они не могли проходить через гелевую сеть. Неполное осаждение хромосомной ДНК может быть возможной ошибкой.
Известно, что пробирка A не содержит плазмиду, но пробирки B и C содержат плазмиду. Это связано с тем, что результаты показывают, что в обеих пробирках B и C присутствуют 2 полосы ДНК, но в пробирке A нет полос ДНК. Плазмидная ДНК, которая находится в E.coli, имеет форму круга. Полосы на верхушках пробирок B и C известны как ник ДНК, они линеаризуются щелочными растворами и не способны к ренатуре. Циркулярная ДНК способна двигаться дальше, так как ее форма вызывает меньшее трение и она меньше по размеру. Ника ДНК не перемещается далеко, поскольку находится в линейной форме, которая вызывает больше трения. И он имеет больший молекулярный размер.
Плазмидная ДНК в пробирке C расщепляется рестриктазой на два фрагмента, поскольку она содержит две последовательности распознавания. Полоса двух фрагментов может перемещаться дальше, чем полоса плазмидной ДНК C, поскольку они испытывают меньшее сопротивление. Следовательно, полоса линейной плазмидной ДНК C имеет более низкое положение, чем кольцевая плазмидная ДНК C. В то время как плазмида в пробирке B расщепляет только один сайт распознавания, круговая плазмида открывается, образуя ник-ДНК. Которые испытывают более высокое трение, чем кольцевая плазмидная ДНК. Следовательно, кольцевая плазмидная ДНК C может перемещаться быстрее, чем ник-плазмидная ДНК C, образуя полосу в низком положении.
Маркер X содержит линейную двухцепочечную ДНК без молекулярного веса. Когда это загружено в электрофорезе, ДНК с различным молекулярным весом бежит в различное положение и формирует лестницу ДНК. Сравнивая полосы линейной плазмидной ДНК из B и C с лестницей, молекулярный вес плазмиды известен. Линейная плазмидная ДНК E. Coli B имеет молекулярную массу 3 т.п.н. Фрагменты линейной плазмидной ДНК имеют молекулярную массу 4,7 и 5,3 т.п.н., поэтому молекулярная масса плазмидной ДНК С составляет 10 т.п.н.
Обсуждение и заключение
Для начала большинство макромолекул, таких как белки, хромосомная ДНК и высокомолекулярная РНК, были удалены с помощью процесса щелочного лизиса. Но из результатов, которые он показал, было несколько макромолекул, которые остались в пробирке С. Возможной причиной того, что пробирка C, содержащая макромолекулы, могла быть пробирка B +, если РНК разложилась с помощью РНКазы. Когда был проведен эксперимент по щелочному лизису, при проведении денатурирования не было ни одной одноцепочечной линейной ДНК, и это показало, что был контроль рН. 5 колоний, устойчивых к антибиотикам, выращивали на чашке 3 с помощью линеаризованной плазмиды В. В пробирке BR линеаризованная плазмида, но в низких точках причина этого в том, что при электрофорезе не было обнаружено кольцевой плазмидной ДНК. После осмотра следует провести колонии, сформированные на пластине L-amp. Когда была проведена бактериальная трансформация, возможно, что часть линеаризованной плазмиды B слилась с хромосомной ДНК.
Использование редактирования и изменения генома для разработки и конструирования атрибутов будущих детей было поддержано и одобрено Советом по биоэтике Наффилда; В докладе говорится, что морально
РНК-интерференция (RNAi) – один из самых захватывающих и революционных новых подходов к терапии, который привлек значительное внимание в течение последних нескольких десятилетий. Было обнаружено, что
В современном мире влияние, которое наука может оказать на жизнь, как мы знаем, остается очень важным. Много исследований проводится в отношении риска вирусных инфекций среди