Аннотация
Клетки РС12 являются общей модельной системой, используемой для изучения нейрональной дифференцировки. Здесь мы представили доказательства, подтверждающие дифференцировку нейронов PC12 в ответ на NGF. Световая микроскопия показала, что клетки РС12 приобретают нейрональные особенности после двух дней лечения, такие как выросты, сходные по морфологии с нейритами и соединениями, которые могут быть синапсами. Иммуноцитохимия для нейронального белка нейрофиламента L (NFT L), белка цитоскелета, который обеспечивает поддержку роста нейритов, продемонстрировала, что уровни NFT L были увеличены и локализованы в видимых нейритах после двух дней лечения NGF. Вместе эти данные указывают на то, что ответ PC12 на NGF является нейрональной дифференцировкой. Чтобы изучить сигнальные события, посредством которых NGF индуцирует дифференцировку, мы исследовали роль Ras, которая, как известно, активируется NGF. Здесь мы чрезмерно экспрессировали постоянно активную форму Ras в клетках РС12.
После этой избыточной экспрессии клетки РС12 проявляли морфологические особенности нейронов, подтверждая тем самым, что Ras индуцирует дифференцировку нейронов. Для дальнейшего изучения сигнальных событий, посредством которых NGF индуцирует дифференцировку нейронов, мы исследовали роль фактора транскрипции Egr1, который, как известно, индуцируется активацией Ras. Здесь мы обнаружили, что когда клетки РС12 обрабатывали NGF, Egr1 экспрессировался. В целом, когда клетки РС12 обрабатывают NGF, все наши результаты дают убедительные доказательства того, что эти клетки подвергаются нейрональной дифференцировке.
Введение
Дифференцировка нейронов необходима во время развития мозга и в течение всей взрослой жизни (хотя и в гораздо меньшей степени в последнем), давая и поддерживая приблизительно сто биллонных нейронов в случае человеческого мозга. Следовательно, понимание молекулярных событий, которые регулируют дифференцировку нейронов, является центральным в нашем понимании нейробиологии человека. Кроме того, понимание молекулярных событий, управляющих дифференцировкой нейронов, имеет терапевтическое значение. Они также являются центром внимания для многих заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера, потому что смерть и деградация нейронов приводят к этим заболеваниям. Одним из возможных способов лечения этих заболеваний является «замена» поврежденных и мертвых нейронов новыми, здоровыми нейронами.
Одной из наиболее распространенных модельных систем, используемых для изучения дифференцировки и функционирования нейронов в течение последних тридцати пяти лет, являются клетки феохромоцитомы-12 (PC12) (Adams). Клетки PC12 были первоначально выделены Tischler и Greene в 1976 году из опухоли надпочечника, растущей у крысы. Вскоре после их выделения было обнаружено, что в отличие от большинства клеточных линий, клетки РС12 подвергаются нейрональной дифференцировке в нейроноподобные клетки после обработки NGF, характеризующейся развитием явных нейритов и синапсов. Это необычное поведение вместе с их способностью к экспериментальным манипуляциям делает клетки РС12 идеальной модельной системой для изучения молекулярных событий, регулирующих дифференцировку нейронов.
Одним из ключевых молекулярных событий, посредством которых NGF индуцирует дифференцировку нейронов PC12, является активация сигнального белка Ras. «Несколько исследований показали, что Ras активируется в клетках РС12 после обработки NGF через рецептор TrkA. Также было показано, что активность Ras регулирует многочисленные факторы транскрипции ». (Adams) Путь, по которому активируется Ras, является частью семейства протеин-серин / треонин-киназ, называемых MAP-киназным путем. Когда Ras активирован, Raf также активируется, который фосфорилирует вторую протеинкиназу, называемую MEK, также фосфорилированную, которая затем активирует ERK. После активации ERK может появиться до трех ответов; пролиферация, дифференцировка и выживание клеток (Купер и Хаусман 617-621). Одним из событий, на которые мы смотрели, является дифференциация, которая является результатом этого пути. Цель этого исследования состояла в том, чтобы охарактеризовать и подтвердить дифференцировку нейронов клеток PC12 в ответ на NGF, и что то, что индуцирует дифференцировку нейронов, является регуляторным белком Ras (Adams).
Одним из ключевых молекулярных событий, который, как показано, регулирует сигнальный белок Ras, является транскрипционный фактор, белок 1 или Egr1 реакции раннего роста. Было проведено много исследований, в которых идентифицировано много транскрипционных факторов, которые могут играть роль в нейрональной дифференцировке клеток РС12, включая Egr1. «Egr1 был идентифицирован как потенциальный регулятор, потому что обработка NGF индуцировала экспрессию нескольких нейрональных генов, которые содержат сайты связывания Egr1 в своих промоторных областях». (Адамс) Эта информация не доказывает, что Egr1 играет роль в дифференцировке нейронов, она только предполагает, что, возможно, играет роль. Чтобы доказать, что Egr1 играет роль в дифференцировке нейронов, когда клетки PC12 обрабатываются NGF, мы докажем первый белок Egr1, присутствующий в дифференцирующихся клетках нейронов, и что он действительно вносит вклад в дифференцировку.
Методы
Световая микроскопия. Световые микрофотографии PC12 были получены с помощью инвертированного микроскопа Tikon TMS с использованием объективов 10x и 20x и программного обеспечения digital plus от Zeiss.
Иммуноцитохимия: 2-х сварная камера была покрыта 200 000 клеток на камеру. После обработки клетки фиксировали в 4% формальдегиде в течение десяти минут. Клетки промывали PBS три раза по 10 секунд каждая. Клетки проникали в 0,5% тритона Х-100 в течение десяти минут. Образцы снова промывали PBS три раза и затем блокировали в 5% NGS в течение одного часа. Затем клетки инкубировали с первичным антителом кроличьего антинейрофиламента L, разведенным в 5% NGF, в течение одной недели при 4ºC. Клетки трижды промывали PBS и инкубировали со вторичным антителом Gt α-Rb IgG-Alexa Fluor488, разведенным в 5% NGS, в течение одного часа, и клетки снова промывали PBS. После мытья пластиковые камеры были удалены с предметного стекла. «Средство для монтажа VectaShield» наносили на предметные стекла, а затем покрывали стеклянным покровным стеклом. Эти слайды были исследованы с помощью флуоресцентного микроскопа. После завершения ICC изображения иммуноокрашивания NFT L получали с использованием флуоресцентного микроскопа с фильтрующим кубиком для обнаружения зеленой флуоресценции, испускаемой IgG-488. Воображения были получены с использованием объективов 4x, 10x и 20x.
Расщепление pGFP и pRas-G12V и электрофорез в агарозе: рестрикционный расщепление готовили для следующего: dH20, реакционный буфер, рестрикционные эндонуклеазы Hpa I, Sma I, BamH I, EcoR I и pGFP и плазмиды pRas-G12V. PGFP подвергали однократному дайджесту с Hpa I и двойному дайджесту с Hpa I и Sma I. pRas-G12V подвергали однократному дайджесту с BamH I и двойному дайджесту с BamH I и EcoR I. Все четыре реакции инкубировали при 37 ° С в течение одного часа, после чего добавляли краситель для загрузки геля и реакции вместе с лестницей ДНК загружали в агарозный гель. Гель-электрофорез проводили в течение девяноста минут при 80 В. Затем гель визуализировали на УФ-боксе.
Трансфекционная визуализация pRas-G12V и количественная оценка дифференциации. Получены флуоресцентные микрофотографии клеток PC12, трансфицированных пустым вектором pGFP +, и клеток PC12, трансфицированных pGFP + pRas-G12V с использованием 20-кратного инвертированного флуоресцентного микроскопа. Чтобы определить, подвергались ли клетки РС12 нейрональной дифференцировке, мы наблюдали, показали ли эти клетки РС12 морфологические особенности нейронов, включающие выросты клеточного тела, сходные с нейритами и синапсами.
SDS Page и Immunoblot: для создания клеточных лизатов культуры сначала промывали PBS, а затем в каждую культуру добавляли буфер для лизиса Лэмли для лизиса клеток. Лизаты затем инкубировали в течение пяти минут при 95ºC и кратковременно центрифугировали. Образцы вместе со стандартным белком загружали на гель для SDS-PAGE. Электрофорез проводили в течение 40 минут при 200 В. После электрофореза белок L трансфицировали на нитроцеллюлозную мембрану с помощью электроблота. Мембраны отмывали в TBS и затем подвергали иммуноблоту. Мембраны инкубировали в течение 30 минут в блокирующем буфере, а затем первичное антитело разводили в блокирующем буфере, который наносили в течение 30 минут. После инкубации первичные антитела промывали TBST. Вторичные антитела разводили в первичных антителах в течение 30 минут и затем снова промывали TBST, а затем визуализировали с помощью хемилюминесцентного изображения. Блоты инкубировали с химическим реагентом в течение 1 минуты, а хемилюминесцен обнаруживали с помощью рентгеновской пленки. Обратите внимание, что эта процедура была повторена дважды.
Реагенты:
Реагенты, использованные в этом эксперименте, рекомбинантный человеческий β-актин был получен от R & D Systems, номер по каталогу 256-GF. Следующие реагенты были заказаны у одной компании Cell Signaling Technology. Следующие реагенты заказаны из этой компании;
U0126 (ингибитор MEK ½), каталожный номер 9903, нейрофиламент-L (C28E10), mAb-каталог кролика, номер-2837, Ras антитело, номер по каталогу 3965, P44 / 42 MAPK (Erk ½), номер по каталогу антитела-9102, Phoso. -P44 / 42 MAPK (Erk ½) (Thr202 / Tyr204) Номер по каталогу антител 9101. Моноклональный анти-β-актин каталожный номер A5441 был заказан у Sigma-Aldrich. Наконец, Egr-1 (588) каталожный номер sc-110 был получен компанией Santa Cruz Biotechnology,
Результаты и обсуждение
Чтобы определить, имеют ли клетки РС12 морфологические признаки, сходные с нейронами, клетки обрабатывали NGF в течение двух дней, а затем исследовали с помощью световой микроскопии. Как показано на фигуре 1, клетки, обработанные NGF, демонстрировали удлинения от своих клеточных тел, сходные по морфологии с нейритами (фигура 1, синяя стрелка), некоторые из которых имели контакты, напоминающие синапсы (фигура 1, красные стрелки). Необработанные клетки были в основном круглой формы, с небольшими или отсутствующими расширениями. Эти результаты свидетельствуют о том, что, когда клетки РС12 подвергаются воздействию NGF, у них развиваются нейроноподобные признаки, возможно, вследствие нейрональной дифференцировки.
Если наблюдаемые изменения морфологии связаны с дифференцировкой нейронов, то они должны сопровождаться активацией нейрональных генов. Чтобы определить, вызывает ли NGF индукцию нейрональных генов, ICC проводили на клетках нейронального белка L нейронального белка (NFT L) до и после двух дней лечения (фиг.2). NFT L был резко увеличен в клетках РС12, обработанных NGF в течение двух дней. Как упоминалось ранее, NFT L является нейрональным белком, который обеспечивает структурную поддержку роста нейритов. Следовательно, его индукция NGF и его локализация в клеточных разрастаниях обеспечивает убедительные доказательства того, что ответ PC12 на NGF представляет собой дифференцировку нейронов.
Затем мы хотели определить потенциальный сигнальный белок, который индуцирует дифференцировку нейронов. Одним сигнальным белком, который, как было показано, индуцирует дифференцировку нейронов, является Ras. Чтобы исследовать потенциальную роль Ras, мы провели эксперимент по трансфекции клеток, клетки трансфицировали плазмидой GFP, которая содержит вставку CDNA размером приблизительно 800 п.н. и фланкирована сайтом рестрикции Sma I в 656 п.н. и сайтом рестрикции Hpa I в 1514 п.н. Другие клетки трансфицировали плазмидой pRas-G12V, которая включает вставку CDNA размером около 800 п.н., фланкированную сайтом рестрикции BamHI в 455 п.н. и сайтом рестрикции EcoR I в 1231 п.н. Для подтверждения того, что эти плазмиды представляли собой pRas-G12V и GFP, было проведено расщепление (фиг.3). Двойное расщепление дало полосы размером примерно 800 п.н., что подтверждает, что этими плазмидами являются pRas-G12V и GFP. Общие результаты доказывают, что две плазмиды, для которых мы проводили расщепление, являются фактическими плазмидами, которые мы хотим использовать в будущих экспериментах. Это предотвращает ошибки при использовании неправильной плазмиды, что делает любые будущие результаты неприменимыми.
Клетки PC12, трансфицированные pRas-G12V (GFP + Ras), демонстрируют морфологические особенности нейрональной дифференцировки, в то время как клетки PC12, трансфицированные pGFP + пустым вектором (GFP), этого не сделали (фигура 4). Клетки РС12, которые были трансфицированы GFP + Ras, обладали морфологическими признаками, которые включали видимый нейрит (красная стрелка) и расширение от тела клетки, сходное по характеристикам с синапсом. Развитие этих морфологических признаков при трансфекции Ras в клетку указывает на то, что Ras индуцирует дифференцировку нейронов.
Дальнейшие эксперименты предоставили доказательства того, что Ras индуцирует дифференцировку нейронов, процент трансфицированных клеток, которые демонстрировали рост нейритов, были подсчитаны на микрофотографиях клеток, трансфицированных GFP и GFP + Ras (фигура 5). Критерии, используемые для определения того, какие клетки были подсчитаны, зависели от того, демонстрировали ли клетки удлинения, сходные по характеристикам с нейритами. Клетки РС12, трансфицированные GFP + Ras, в среднем имели больше клеток, которые проявляли морфологические особенности нейронов, чем клетки, трансфицированные GFP. Средний% дифференциации для GFP + Ras составил 45,9% со стандартной ошибкой 6,3, в то время как средний% дифференциации для GFP составил 7,6% со стандартной ошибкой 2,9. Клетки РС12, трансфицированные GFP + Ras, имеют на 43% более высокую степень дифференцировки, чем клетки РС12, трансфицированные только GFP. Эти результаты подтверждают рабочую гипотезу о том, что NGF индуцирует дифференцировку нейронов клеток РС12 посредством активации Ras, на что указывает большее количество клеток РС12, проявляющих морфологические особенности нейронов при трансфекции с помощью Ras.
Ras сверхэкспрессируется в клетках, трансфицированных GFP и GFP + Ras, на что указывает присутствие темной сплошной полосы, полученной при проведении вестерн-блоттинга для проверки на наличие Ras и β-актина в качестве контроля (фигура 6 ). Этот вестерн-блот подтвердил избыточную экспрессию Ras в клетках, трансфицированных GFP + Ras. Это избыточное выражение заставляет клетки развивать морфигические особенности, которые напоминают нейроны. В заключение, активация Ras вызывает дифференцировку нейронов, когда клетки РС12 обрабатывают NGF.
Фактором транскрипции, который, как известно, активируется Ras, является Egr1. В предыдущих экспериментах было показано, что Egr1 экспрессируется, когда клетки РС12 обрабатывают NGF. Перед экспрессией Egr1 после одного часа обработки NGF NFT L была экспрессией. (рисунок 13.2) Выражение NFT L i …
Есть несколько разных циклов, вокруг которых вращается Земля. Некоторые из циклов были затронуты катастрофой Фукусима-Дайхатсу. Завод в Фукусиме пострадал от землетрясения силой 9,0 балла. Растения,
Трение – это сила, которая приводит к предотвращению движения объекта. Трение повсюду, когда один объект вступает в контакт с другим, возникает трение. Сила действует в
Тиристор – это тип диода, который позволяет току течь тогда и только тогда, когда на его клемму затвора подается управляющее напряжение. Этот вид диода имеет