Высокоэффективная жидкостная хроматография – это аналитическая методика, используемая для разделения, идентификации и количественного определения каждого компонента в смеси. Жидкий растворитель, содержащий смесь образцов, проходит через колонку, заполненную твердым адсорбирующим материалом. Каждый компонент в образце по-разному взаимодействует с адсорбирующим материалом, вызывая разные скорости потока для разных компонентов и приводя к разделению компонентов по мере их вытекания из колонки.
ВЭЖХ использовалась для производства (например, в процессе производства фармацевтических и биологических продуктов), юридического (например, обнаружения лекарств для повышения эффективности в моче), исследований (например, для разделения компонентов сложного биологического образца или подобных синтетических химикатов). друг от друга), а также медицинские (например, определение уровня витамина D в сыворотке крови).
Хроматография может быть описана как адсорбция массопереноса. ВЭЖХ содержит насосы для пропускания жидкости под давлением и смеси образцов через колонку, заполненную адсорбентом, что приводит к разделению компонентов образца. Активный компонент колонны, адсорбент, обычно представляет собой гранулированный материал, состоящий из твердых частиц (например, диоксида кремния, полимеров и т. Д.), Размером от 2 до 50 микрометров. Компоненты образца смеси разделены по их различным степеням взаимодействия с частицами адсорбента. Жидкость под давлением обычно представляет собой смесь растворителей (например, воды, ацетонитрила и / или метанола) и называется «подвижной фазой». Его состав и температура играют главную роль в процессе разделения. Эти взаимодействия носят физический характер, такие как гидрофобный (дисперсионный), диполь-дипольный и ионный, чаще всего их сочетание.
ВЭЖХ отличается от традиционной («низкого давления») жидкостной хроматографии, поскольку рабочее давление значительно выше (50–350 бар), в то время как обычная жидкостная хроматография, как правило, зависит от силы тяжести для прохождения подвижной фазы через колонку. Из-за небольшого количества образца, разделенного в аналитической ВЭЖХ, типичные размеры колонки составляют 2,1–4,6 мм в диаметре и 30–250 мм в длину. Кроме того, колонки ВЭЖХ сделаны с более мелкими частицами сорбента (средний размер частиц 2–50 микрометров). Это дает ВЭЖХ превосходную разрешающую способность (способность различать соединения) при разделении смесей, что делает его популярным методом хроматографии.
Техника разделения HILIC. Полезный диапазон. Разделительная хроматография была одним из первых видов хроматографии, разработанных химиками. Принцип коэффициента распределения был применен в бумажной хроматографии, тонкослойной хроматографии, газовой фазе и разделении жидкости и жидкости. В 1952 году Арчер Джон Портер Мартин и Ричард Лоуренс Миллингтон Синдж получили Нобелевскую премию по химии за разработку этой технологии, которая использовалась для разделения аминокислот. Как и в хроматографии с гидрофильным взаимодействием (HILIC; подтехника в ВЭЖХ), этот метод разделяет аналиты на основе различий в их полярности. HILIC использует связанную полярную стационарную фазу и подвижную фазу, состоящую в основном из ацетонитрила с водой в качестве сильного компонента. Разделительная ВЭЖХ использовалась на несвязанных носителях из диоксида кремния или оксида алюминия. Он эффективно разделяет аналиты по относительным полярным различиям. Связанные HILIC фазы разделяют кислые, основные и нейтральные растворенные вещества в одном хроматографическом цикле.
Полярные аналиты диффундируют в стационарный водный слой, связанный с полярной стационарной фазой, и, таким образом, сохраняются. Чем сильнее взаимодействия между полярным анализируемым веществом и полярной стационарной фазой (относительно подвижной фазы), тем дольше время элюирования. Сила взаимодействия зависит от части функциональных групп молекулярной структуры аналита с более поляризованными группами (например, гидроксильными) и группами, способными к образованию водородных связей, вызывающими большее удержание. Удержание также увеличивается за счет кулоновских (электростатических) взаимодействий. Время удерживания аналитов было уменьшено с использованием более полярных растворителей в подвижной фазе. тогда как время удерживания было увеличено для более гидрофобных растворителей.
Нормально-фазовая хроматография [править]
Нормально-фазовая хроматография была одним из первых видов ВЭЖХ, разработанных химиками. Также известный как ВЭЖХ с нормальной фазой (NP-HPLC), этот метод отделяет анализируемые вещества на основе их сродства от полярной неподвижной поверхности, такой как диоксид кремния, следовательно, он основан на способности аналита участвовать в полярных взаимодействиях (таких как водородная связь или дипольная связь). дипольный тип взаимодействия) с поверхностью сорбента. NP-HPLC использует неполярную неводную подвижную фазу (например, хлороформ) и эффективно работает для разделения аналитов, легко растворимых в неполярных растворителях. Аналит связывается и удерживается полярной стационарной фазой. Сила адсорбции увеличивается с увеличением полярности аналита. Сила взаимодействия зависит не только от функциональных групп, присутствующих в структуре молекулы аналита, но и от стерических факторов. Влияние стерических помех на силу взаимодействия позволяет этому методу разделять (разделять) структурные изомеры.
Использование более полярных растворителей в подвижной фазе уменьшит время удерживания аналитов, тогда как более гидрофобные растворители имеют тенденцию вызывать более медленное элюирование (увеличенное время удерживания). Очень полярные растворители, такие как следы воды в подвижной фазе, имеют тенденцию адсорбироваться на твердой поверхности стационарной фазы, образуя неподвижный связанный (водный) слой, который, как считается, играет активную роль в удерживании. Это поведение в некоторой степени свойственно нормальной хроматографии, потому что оно регулируется почти исключительно адсорбционным механизмом (т.е. аналиты взаимодействуют с твердой поверхностью, а не с сольватированным слоем лиганда, прикрепленным к поверхности сорбента; см. Также ВЭЖХ с обращенной фазой ниже) , Адсорбционная хроматография все еще широко используется для разделения структурных изомеров как в колоночной, так и в тонкослойной хроматографии на носителях из активированного (высушенного) диоксида кремния или оксида алюминия.
Разделительная и NP-HPLC потеряли популярность в 1970-х годах с развитием ВЭЖХ с обращенной фазой из-за плохой воспроизводимости времени удержания из-за присутствия слоя воды или протонного органического растворителя на поверхности кремнезема или глиноземные хроматографические среды. Этот слой изменяется с любыми изменениями в составе подвижной фазы (например, уровнем влажности), вызывающими время удержания дрейфа.
В последнее время разделительная хроматография снова стала популярной благодаря разработке фаз, связанных с Hilic, которые демонстрируют улучшенную воспроизводимость и благодаря лучшему пониманию диапазона полезности этого метода.
вытеснительная хроматография
Основной принцип вытеснительной хроматографии: молекула с высоким сродством к матрице хроматографии (вытеснитель) будет эффективно конкурировать за сайты связывания и, таким образом, вытеснит все молекулы с меньшим сродством. [11] Есть четкие различия между вытеснительной и элюирующей хроматографией. В режиме элюирования вещества обычно выходят из колонны в узких гауссовых пиках. Широкое разделение пиков, предпочтительно до базовой линии, желательно для достижения максимальной очистки. Скорость, с которой любой компонент смеси движется вниз по колонне в режиме элюирования, зависит от многих факторов. Но для того, чтобы два вещества перемещались с разными скоростями и, следовательно, были разрешены, должны быть существенные различия в некотором взаимодействии между биомолекулами и хроматографической матрицей. Рабочие параметры регулируются, чтобы максимизировать влияние этой разницы. Во многих случаях базовое разделение пиков может быть достигнуто только при градиентном элюировании и низких нагрузках на колонку. Таким образом, двумя недостатками хроматографии в режиме элюирования, особенно в препаративном масштабе, являются сложность эксплуатации из-за градиентной откачки растворителя и низкая пропускная способность из-за низких нагрузок на колонку. Смещающая хроматография имеет преимущества перед элюционной хроматографией в том, что компоненты разделяются в последовательные зоны чистых веществ, а не в «пики». Поскольку в процессе используется преимущество нелинейности изотерм, на данную колонку можно разделить более крупную подачу из колонки с очищенными компонентами, извлеченными при значительно более высокой концентрации.
Обращенно-фазовая хроматография (RPC)
Хроматограмма сложной смеси (парфюмерная вода), полученной с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой
Для получения дополнительной информации по этой теме см. обращенно-фазовую хроматографию.
Обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ) имеет неполярную стационарную фазу и водную умеренно полярную подвижную фазу. Одна обычная стационарная фаза представляет собой диоксид кремния, который был модифицирован на поверхности с помощью RMe2SiCl, где R представляет собой алкильную группу с прямой цепью, такую как C18H37 или C8H17. С такими стационарными фазами время удерживания больше для молекул, которые менее полярны, в то время как полярные молекулы элюируются легче (в начале анализа). Исследователь может увеличить время удержания, добавляя больше воды в подвижную фазу; тем самым усиливая сродство гидрофобного аналита к гидрофобной стационарной фазе по сравнению с более гидрофильной подвижной фазой. Точно так же исследователь может уменьшить время удерживания, добавляя больше органического растворителя к элюенту. RP-HPLC используется так часто, что его часто неправильно называют «ВЭЖХ» без дополнительной спецификации. Фармацевтическая промышленность регулярно применяет RP-HPLC для квалификации лекарств перед их выпуском.
RP-ВЭЖХ работает по принципу гидрофобных взаимодействий, который обусловлен высокой симметрией дипольной структуры воды и играет наиболее важную роль во всех процессах в науке о жизни. RP-HPLC позволяет измерять эти интерактивные силы. Связывание аналита со стационарной фазой пропорционально площади контактной поверхности вокруг неполярного сегмента молекулы аналита при ассоциации с лигандом в неподвижной фазе. В этом солвофобном эффекте преобладает сила воды для «сокращения полости» вокруг аналита и цепи C18 по сравнению с комплексом обоих. Энергия, выделяемая в этом процессе, пропорциональна поверхностному натяжению элюента (вода: 7,3? 10-6 Дж / см ?, метанол: 2,2? 10-6 Дж / см?) И гидрофобной поверхности аналита и лиганд соответственно. Удержание может быть уменьшено путем добавления менее подвижного растворителя (метанол, ацетонитрил) в подвижную фазу, чтобы уменьшить поверхностное натяжение воды. Градиентное элюирование использует этот эффект, автоматически уменьшая полярность и поверхностное натяжение водной подвижной фазы в ходе анализа.
Структурные свойства молекулы аналита играют важную роль в его удерживающих характеристиках. В общем, аналит с большей гидрофобной площадью поверхности (C – H, C – C и обычно неполярными атомными связями, такими как S-S и др.) Сохраняется дольше, потому что он не взаимодействует со структурой воды. С другой стороны, аналиты с более высокой площадью полярной поверхности (обусловленные наличием в их структуре полярных групп, таких как -OH, -NH2, COO- или -NH3 +) менее сохраняются, поскольку они лучше интегрируются в воду. Такие взаимодействия подвержены стерическим эффектам в том смысле, что очень большие молекулы могут иметь только ограниченный доступ к порам стационарной фазы, где имеют место взаимодействия с поверхностными лигандами (алкильными цепями). Такое поверхностное препятствие обычно приводит к меньшей задержке.
Время удерживания увеличивается с увеличением гидрофобной (неполярной) площади поверхности. Соединения с разветвленной цепью элюируются быстрее, чем их соответствующие линейные изомеры, потому что общая площадь поверхности уменьшается. Аналогичным образом, органические соединения с одинарными связями C – C элюируются позже, чем соединения с тройной связью C = C или C – C, поскольку двойная или тройная связь короче, чем простая связь C – C.
Помимо поверхностного натяжения подвижной фазы (организационная сила в структуре элюента), другие модификаторы подвижной фазы могут влиять на удержание аналита. Например, добавление неорганических солей вызывает умеренное линейное увеличение поверхностного натяжения водных растворов (приблизительно 1,5? 10-7 Дж / см? На моль для NaCl, 2,5? 10-7 Дж / см? На моль для ( NH4) 2SO4), и поскольку энтропия границы раздела аналит-растворитель контролируется поверхностным натяжением, добавление солей имеет тенденцию увеличивать время удерживания. Этот метод используется для мягкого разделения и восстановления белков и защиты их биологической активности при анализе белков (хроматография гидрофобного взаимодействия, HIC).
Другим важным фактором является рН подвижной фазы, поскольку он может изменить гидрофобный характер аналита. По этой причине большинство методов используют буферный агент, такой как фосфат натрия, для контроля pH. Буферы служат нескольким целям: контролируют рН, нейтрализуют заряд на поверхности кремнезема неподвижной фазы и действуют в качестве ионных спаривающих агентов для нейтрализации заряда аналита. Формиат аммония обычно добавляют в масс-спектрометрию для улучшения обнаружения определенных аналитов путем образования аддуктов аналит-аммоний. Летучая органическая кислота, такая как уксусная кислота или чаще всего муравьиная кислота, часто добавляется в подвижную фазу, если масс-спектрометрия используется для анализа стоков колонки. Трифторуксусная кислота редко используется в применениях масс-спектрометрии из-за ее стойкости в детекторе и системе доставки растворителя, но может быть эффективной для улучшения удерживания аналитов, таких как карбоновые кислоты, в применениях, использующих другие детекторы, поскольку это довольно сильная органическая кислота. Эффекты кислот и буферов варьируются в зависимости от применения, но обычно улучшают хроматографическое разрешение.
Колонки с обращенной фазой довольно трудно повредить по сравнению с обычными колонками с диоксидом кремния; однако многие колонки с обращенной фазой состоят из частиц диоксида кремния, дериватизированных алкилом, и никогда не должны использоваться с водными основаниями, так как они разрушат нижележащие частицы диоксида кремния. Их можно использовать с водной кислотой, но …
Есть несколько разных циклов, вокруг которых вращается Земля. Некоторые из циклов были затронуты катастрофой Фукусима-Дайхатсу. Завод в Фукусиме пострадал от землетрясения силой 9,0 балла. Растения,
Трение – это сила, которая приводит к предотвращению движения объекта. Трение повсюду, когда один объект вступает в контакт с другим, возникает трение. Сила действует в
Тиристор – это тип диода, который позволяет току течь тогда и только тогда, когда на его клемму затвора подается управляющее напряжение. Этот вид диода имеет