Идентификация и характеристика неизвестного гена Brachypodium distachyon
Введение
Современные биологические исследования совпали с ростом биоинформатики, так как такие исследователи сегодня лучше, чем когда-либо прежде, готовы решать новые и сложные задачи. С момента своего создания до наших дней количество геномных последовательностей в базе данных NCBI WGS увеличилось в геометрической прогрессии с 172 тысяч до более чем 584 миллионов последовательностей. Достижения в области генетического секвенирования наряду с простотой доступа к этим большим базам данных последовательностей предоставили исследователям мощные инструменты для выяснения функции неизвестных генов. В этой лаборатории наше исследование основывалось на этих биоинформационных инструментах в попытке выяснить как функцию, так и идентичность неизвестного гена из нашего организма Brachypodium distachyon.
Многие из этих геномных баз данных основаны на подходе дробовика к секвенированию всего генома. Из-за нашего интереса к генной функции наша последовательность была сравнена с базой данных экспрессированных меток последовательности (ESTs) из библиотеки комплементарной ДНК (кДНК). EST представляют этот подход к секвенированию ДНК, поскольку они представляют собой короткие последовательности более крупных последовательностей кДНК. Такой подход к секвенированию предпочтителен из-за ограничений по стоимости и времени, связанных с секвенированием целых библиотек кДНК.
Полные геномные последовательности можно сравнить с этими базами данных EST и получить несколько совпадений для EST с различными уровнями сходства последовательностей. Затем лучшие совпадения могут быть объединены в более длинную непрерывную последовательность с использованием других биоинформационных инструментов. Этот подход может помочь сузить важную кодирующую последовательность из большей геномной последовательности. Затем непрерывную последовательность можно сравнить с большими базами данных последовательностей в попытке идентифицировать последовательность кДНК, которая могла быть ранее охарактеризована.
Рисунок 1: Результаты анализа FGENESH последовательности геномной ДНК Brachypodium distachyon. CDSo (кодирующая последовательность, соло) указывает на один экзон. Предсказанный сайт polA обозначен зеленым бриллиантом. Последовательность начинается в нт 904 и заканчивается сайтом polA в нт 2549.
В дополнение к нуклеотидным базам данных, белковые базы данных могут использоваться для определения функции или структуры белка. Существует ряд инструментов, помогающих идентифицировать консервативные домены неизвестного белка на основе аминокислотной последовательности. Гомологи неизвестного белка могут быть легко идентифицированы и могут дать представление о функции этого белка.
Нашей целью было создать непрерывную последовательность на основе этих методов, сравнить нашу последовательность с другими ранее охарактеризованными последовательностями кДНК, использовать биоинформационные инструменты, чтобы определить, был ли ранее охарактеризован наш ген, и потенциально идентифицировать функцию этого гена и его продукта. .
Материалы и методы
Эксперименты проводились точно так же, как описано в руководстве
Результаты
Рисунок 2: Результаты NCBI BLAST с использованием базы данных с выраженной меткой последовательности (EST) для Brachypodium distachyon. Каждая строка представляет один EST. Результаты основаны на сходстве последовательностей и цветовой кодировке на основе ключа, видимого над строкой запроса.
Рисунок 3: Вверху: результаты BLAST для фитозом, показывающие непрерывное совпадение кДНК (синее) и предсказание транскрипта аминокислоты. Внизу: вид белкового домена на основе аминокислотной последовательности фитозома для гена Bradi1g06290. Наличие двух доменов фасциклина указано желтым.
Рисунок 4. Слева: совпадения последовательностей ДНК из базы данных нуклеотидов (NCBI). Многие из этих совпадений происходят из разных видов однодольных растений. Первый экзон, по-видимому, высоко консервативен для разных видов, а второй менее консервативен. Справа: совпадения аминокислотных последовательностей из базы данных NCBI. Этот белок высоко консервативен среди различных видов растений. Большинство из перечисленных белковых гомологов представляют собой фасциклиноподобные арабиногалактановые белки различных организмов, включая A. thaliana.
Рисунок 5. График прогнозируемых свойств нашего белка по аминокислотам. Горизонтальная ось представляет аминокислотное число, начинающееся с N-конца, с достоверностью прогноза, обозначенной вертикальной осью. Область сигнального пептида предсказывается на N-конце белка (красный след), в то время как остаток белка, как предсказывают, нецитоплазматический (синий след).
Рисунок 6: Сходство последовательности между Bradi1g06290 и FLA16. Сходство последовательности имеет цветовую кодировку, основанную на% идентичности, см. Шкалу сходства.
Рисунок 7: Линейный вид типичного FLA, показывающий два домена фасциклина, два домена AGP, сигнал GPI и сигнал секреции. (По материалам Johnson et al, 2011)
Анализ in vitro нашей геномной последовательности с использованием программного обеспечения для идентификации генов показал наличие одного экзона (рис. 1). При поиске совпадений EST для нашей геномной ДНК мы обнаружили много результатов, содержащих небольшие сегменты, охватывающие эту предсказанную область экзона (рис. 2). С помощью анализа фитозом мы смогли идентифицировать присутствие двух экзонов и одного интрона, а также определить название нашего гена – Bradi1g06290. Кроме того, мы смогли определить, что два белка фасциклина присутствуют в нашем белке на основе предсказанной аминокислотной последовательности, данной фитозомой (рис. 3). Благодаря использованию нуклеотидного взрыва NCBI мы идентифицировали несколько гомологичных генов среди различных видов растений, используя нашу геномную последовательность. Используя белковый взрыв NCBI, мы идентифицировали несколько гомологичных белков с высоким уровнем сходства последовательностей среди многих различных видов растений (рис. 4). Наконец, мы использовали Phobius для предсказания сигнальных доменов в нашем белке на основе последовательности. Результаты Phobius указывают на присутствие сигнального домена от остатка 1 до 26 Bradi1g06290 (рисунок 5). Bradi1g06290 сравнивали с FLA16 Arabidopsis thaliana с использованием программного обеспечения для сравнения последовательностей (фиг.6). Структура типичного FLA, состоящего из двух доменов fas, двух доменов AGP и якоря GPI, была раскрыта в нашем обзоре литературы (рис. 7).
Обсуждение
Посредством биоинформационного анализа мы определили наш ген как Bradi1g06290. На основании анализа фитозом мы определили, что Bradi1g06290 содержит два экзона и один интрон. Кроме того, анализ белкового домена фитозом показал наличие двух доменов фасциклина. Используя NCBI BLAST, мы определили, что эти домены являются консервативными среди многих видов растений. Мы ввели нашу аминокислотную последовательность в конкретную базу данных Arabidopsis thaliana (TAIR) и определили, что наш ген имеет высокое сходство последовательностей с рядом белков, известных как фасциклин-подобные арабиногалактаны (FLA). Затем мы провели обзор литературы нашего гена на основе этих результатов.
FLA обычно состоят из двух доменов фасциклина и двух доменов арабиногалактанового белка (AGP) (Johnson et al., 2011). Каждый из этих доменов вносит свой вклад в определенные свойства FLA и может выполнять довольно разнообразный набор функций в ячейке. Домены фасциклина в основном участвуют в адгезии клеток. Принимая во внимание, что домены AGP могут выполнять ряд различных функций, включая, но не ограничиваясь этим, передачу сигналов клетки, пролиферацию клеток, определение клеток и соматический эмбриогенез (Johnson et al, 2003).
Наш анализ действительно выявил присутствие небольшого сигнального домена в нашем белке, что может поддержать гипотезу о том, что наш белок участвует в передаче сигналов. Мы провели дальнейший анализ, сравнивая нашу последовательность с подмножеством FLA Arabidopsis thaliana, классифицируемых как FLA группы B. Наши результаты показали, что домены фасциклина хорошо сохраняются среди этих FLA, однако мотивы AGP имеют небольшую вариабельность, и мы имели более низкое сходство последовательностей в этих областях (рис. 6).
Было высказано предположение, что FLA с якорями GPI (гликозилфосфатидилинозитол) могут функционировать в качестве сигнальных молекул, в результате чего расщепление отделяет AGP от якоря GPI, и AGP высвобождается во внеклеточную среду, чтобы действовать в качестве сигнальной молекулы (Johnson et al., 2003) .
На основании нашего сходства последовательностей и наличия сигнальной области мы считаем, что это может быть возможной функцией нашего белка. Однако в настоящее время нет достаточных доказательств в поддержку этой гипотезы. Существует очень мало информации о специфической роли FLA класса B, и мы не смогли подтвердить присутствие доменов AGP в нашем белке. Домены AGP могут присутствовать и не иметь характеристики, или они могут отсутствовать полностью. Кроме того, существуют противоречивые аргументы относительно того, содержат ли FLA класса B привязку GPI вообще. Поэтому в настоящее время мы не можем определить специфическую функцию нашего белка.
Использование редактирования и изменения генома для разработки и конструирования атрибутов будущих детей было поддержано и одобрено Советом по биоэтике Наффилда; В докладе говорится, что морально
РНК-интерференция (RNAi) – один из самых захватывающих и революционных новых подходов к терапии, который привлек значительное внимание в течение последних нескольких десятилетий. Было обнаружено, что
В современном мире влияние, которое наука может оказать на жизнь, как мы знаем, остается очень важным. Много исследований проводится в отношении риска вирусных инфекций среди