Он объединяет молекулы ДНК двух разных видов, которые вставляются в организм хозяина для создания новых генетических комбинаций, представляющих ценность для науки, медицины, сельского хозяйства и промышленности. Поскольку в центре внимания всей генетики находится ген, основной целью лабораторных генетиков является выделение, характеристика и манипулирование генами. Хотя выделить образец ДНК из набора клеток относительно легко, обнаружение определенного гена в этом образце ДНК можно сравнить с поиском иголки в стоге сена. Рассмотрим тот факт, что каждая человеческая клетка содержит приблизительно 2 метра (6 футов) ДНК. Поэтому маленький образец ткани будет содержать много километров ДНК. Тем не менее, технология рекомбинантной ДНК позволила выделить один ген или любой другой сегмент ДНК, что позволило исследователям определить ее нуклеотидную последовательность, изучить ее транскрипты, мутировать ее весьма специфическими способами и повторно вставить модифицированную последовательность в живой организм.
Определение: серия процедур, которые используются для объединения (рекомбинации) сегментов ДНК. Молекула рекомбинантной ДНК состоит из сегментов двух или более различных молекул ДНК. При определенных условиях молекула рекомбинантной ДНК может проникать в клетку и размножаться там либо самостоятельно, либо после ее интеграции в хромосому.
Требования к продуцированию рДНК:
- I. Ген интереса, который нужно клонировать.
- II. Молекулярные ножницы, чтобы вырезать ген интереса.
- III. Молекулярный носитель или вектор, на котором может быть размещен интересующий ген.
- IV. Интересующий ген вместе с вектором затем вводится в систему экспрессии, в результате чего получается конкретный продукт.
Как получить ген?
- I. Изолировать его от хромосомы;
- II. Синтезировать это химически; и
- III. Сделай это из мРНК.
Гены могут быть выделены из хромосом путем разрезания хромосом на фланкирующих участках гена с использованием специальных ферментов, известных как эндонуклеазы рестрикции. (2)
Основы рДНК: что такое рДНК?
Прежде чем мы перейдем к «r» части ДНК, нам нужно понять ДНК. Вся ДНК состоит из сахара рибозы, азотистых оснований и фосфатов. Есть четыре азотистых основания аденин (A), тимин (T), гуанин (G) и цитозин (C). Эти азотистые основания находятся в парах, причем A & T и G & C соединены вместе.
Эти основания могут быть расположены бесконечным образом, что приводит к образованию знаменитой структуры «двойная спираль», как показано на рисунке:
Сахар, используемый в ДНК, представляет собой дезоксирибозу (кислород удаляется из 2-го углерода сахара). Все эти четыре основания одинаковы во всех организмах, но разнообразие их расположения и последовательности в ДНК ведет к разнообразию. ДНК на самом деле не делает организм, а производит белки. Затем ДНК транскрибируется в мРНК, а затем переводится в белок, который образует организм. При изменении последовательности ДНК образующийся белок также изменится. Это приводит либо к другому белку, либо к неактивному белку.
Теперь мы знаем, что такое ДНК. Рекомбинантная ДНК объединяет две цепи разных ДНК. Таким образом, имя является рекомбинантным! который иногда также называют «химерой». Комбинируя различные цепи ДНК, ученый может создать другую комбинацию ДНК.
Как производится рекомбинантная ДНК?
Существует три разных способа получения рекомбинантной ДНК:
<Р> 1. Преобразование;
2. Введение фага; и
3. Небактериальная трансформация.
Получение ДНК:
Этап 1. Фрагмент ДНК, содержащий последовательность гена, подлежащую клонированию (также известную как «вставка»), выделяют.
Шаг 2. Разрезание ДНК
Шаг 3. Присоединение к ДНК
Шаг 2. Вставка этих фрагментов ДНК в клетку-хозяина с использованием «вектора» (молекулы ДНК-носителя).
Шаг 3. Молекулы рДНК генерируются, когда вектор самовоспроизводится в клетке-хозяине.
Шаг 4. Перенос молекул рДНК в подходящую клетку-хозяина.
Шаг 5: Отбор клеток-хозяев, несущих молекулу рДНК, с использованием маркера
Шаг 6. Репликация клеток, несущих молекулы рДНК, для получения генетически идентичной популяции или клона клеток.
Первым шагом в создании рекомбинантной ДНК является выделение донорной и векторной ДНК. Процедура, используемая для получения векторной ДНК, зависит от природы вектора. Бактериальные плазмиды являются обычно используемыми векторами, и эти плазмиды должны быть очищены от бактериальной геномной ДНК.
Ультрацентрифугирование:
Протокол экстракции плазмидной ДНК может быть достигнут ультрацентрифугированием. Плазмидная ДНК образует четкую полосу после ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия, содержащего бромид этидия. Плазмидную ленту собирают, пробивая отверстие в пластиковой пробирке для центрифугирования.
Щелочной лизис:
<Р>
Другой протокол основан на наблюдении, что при определенном щелочном pH денатурирует геномная ДНК бактерий, а плазмиды – нет. Последующая нейтрализация осаждает геномную ДНК, но плазмиды остаются в растворе. Фаги, такие как? также могут быть использованы в качестве векторов для клонирования ДНК в бактериальных системах. Фаговая ДНК выделяется из чистой суспензии фагов, выделенной из лизата фагов.
Режущая ДНК
Фермент рестрикции EcoRI разрезает кольцевую молекулу ДНК, несущую одну последовательность-мишень, в результате чего получается линейная молекула с одноцепочечными липкими концами.
Присоединение к ДНК: вставка
Вектор – это любая молекула ДНК, которая способна размножаться внутри хозяина, в который интегрирован наш интересующий ген для клонирования. В этом процессе фермент рестрикции выполняет функцию ножниц для разрезания молекул ДНК. Фермент лигаза является соединяющим ферментом, который соединяет векторную ДНК с представляющим интерес геном. это произведет рекомбинантную ДНК.
Определение:
Это процесс для вставки чужеродной ДНК в бактерии, может использоваться для надежного введения ДНК в бактерии.
<Р> Методы
<Р> 1. Преобразование хлорида кальция:
При трансформации хлорида кальция клетки получают путем охлаждения клеток в присутствии Ca2 + (в растворе CaCl2), благодаря чему клетки становятся проницаемыми для плазмидной ДНК. Клетки инкубируют на льду с ДНК, а затем кратковременно подвергают тепловому шоку (например, при 42 ° С в течение 30–120 секунд). Этот метод очень хорошо работает для кольцевой плазмидной ДНК. Некоммерческие препараты обычно дают от 106 до 107 трансформантов на микрограмм плазмиды; плохой препарат будет около 104 / мкг или менее, но хороший препарат компетентных клеток может дать до ~ 108 колоний на микрограмм плазмиды. Протоколы, однако, существуют для создания суперкомпетентных клеток, которые могут давать эффективность трансформации более 109. Однако химический метод обычно не работает хорошо для линейной ДНК, такой как фрагменты хромосомной ДНК, вероятно, потому что ферменты нативной экзонуклеазы в клетке быстро разлагать линейную ДНК. Напротив, клетки, которые являются компетентными по природе, обычно более эффективно трансформируются линейной ДНК, чем плазмидной ДНК. (4)
<Р> 2. Электропорация:
Электропорация или электропермеабилизация – это метод микробиологии, в котором электрическое поле применяется к клеткам для увеличения проницаемости клеточной мембраны, позволяя химикатам, лекарствам или ДНК вводиться в клетку. [1] В микробиологии процесс электропорации часто используется для трансформации протопластов бактерий, дрожжей или растений путем введения новой кодирующей ДНК. Если бактерии и плазмиды смешаны вместе, плазмиды могут быть перенесены в бактерии после электропорации, хотя в зависимости от того, что переносится, проникающие в клетку пептиды или CellSqueeze также могут быть использованы. Электропорация работает, пропуская тысячи вольт через расстояние от одного до двух миллиметров взвешенных клеток в кювете электропорации (1,0 – 1,5 кВ, 250 – 750 В / см). После этого с клетками нужно обращаться осторожно, пока у них не будет возможности делиться, производя новые клетки, которые содержат воспроизводимые плазмиды. Этот процесс примерно в десять раз эффективнее, чем химическое превращение.
Выбираемые маркеры могут относиться к устойчивости к антибиотикам, изменениям цвета или любым другим признакам, которые могут отличать трансформированных хозяев от нетрансформированных хозяев. Различные векторы имеют разные свойства, что делает их пригодными для разных применений. Некоторые свойства могут включать симметричные сайты клонирования, размер и большое количество копий.
Типы выборов
Выбор антибиотиков
Это метод, в котором трансформированные бактериальные клетки высевают на чашки с агаром с различными антибиотиками в качестве способа идентификации рекомбинантных бактерий и нетрансформированных клеток. Процедура Трансформированные бактерии высевают на чашки с агаром, которые содержат антибиотик-ампициллин или любой другой. Нетрансформированные бактерии не могут расти в присутствии ампициллина, поскольку в них отсутствуют плазмиды ампициллина, содержащие ген устойчивости к ампициллину (ampR).
Недостаток
Отбор антибиотиков сам по себе не позволяет отличить трансформированные бактерии с нерекомбинантной плазмидой, которая рециркулировала из рекомбинантных плазмид.
Сине-белый выбор
<Р>
Это метод, используемый для различения рекомбинантных бактерий и нерекомбинантных бактерий (содержащих плазмиду без чужеродной ДНК). Процедура В этой чашке с агаром также содержится хромогенный (цветообразующий) субстрат для B-gal, называемый X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-BD-галактопиранозид). X-gal аналогичен лактозе в структура и становится синим при расщеплении B-гал. В результате, нерекомбинантные бактерии – те, которые содержат плазмиду, лигированную обратно в себя без вставки ДНК, содержат функциональный ген LacZ, продуцируют B-gal и становятся синими. И наоборот, рекомбинантные бактерии идентифицированы как белые колонии. Поскольку эти клетки содержат плазмиду с чужеродной ДНК, вставленной в ген lacZ, B-gal не продуцируется, и эти клетки не могут метаболизировать X-gal. Следовательно, с помощью сине-белого отбора нетрансформированные и нерекомбинантные бактерии отбирают против, и белые колонии идентифицируют или отбирают в качестве желательных колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды.
Небактериальная трансформация
Этот процесс очень похож на преобразование. Разница лишь в том, что небактериальные бактерии, такие как E.Coli, не используют для хозяина. При микроинъекции ДНК непосредственно вводится в ядро трансформируемой клетки. В биолистике клетки-хозяева бомбардируют высокоскоростными микрочастицами, такими как частицы золота или вольфрама, которые были покрыты ДНК.
Введение в Phage
<Р>
Фаговое введение – это процесс трансфекции, который эквивалентен трансформации, за исключением того, что вместо бактерий используется фаг. In vitro используется упаковка вектора. При этом используются лямбда- или MI3-фаги для получения фаговых бляшек, которые содержат рекомбинанты. Созданные рекомбинанты могут быть идентифицированы по различиям в рекомбинантах и нерекомбинантах с использованием различных методов отбора. ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК-ТЕХНОЛОГИИТри важных приложений: (1) применение в улучшении урожая, (2) применение в лекарственных средствах; и (3) Промышленное применение.
<сильный> I. Приложения для улучшения урожая:
Генная инженерия имеет несколько потенциальных применений в улучшении урожая, как указано ниже:
<Р> <сильный> 1. Дистанционная гибридизация:
С развитием генной инженерии стало возможным передавать гены между отдаленно родственными видами. Барьеры переноса генов между видами или даже родами были преодолены. Желательные гены могут передаваться даже от низших организмов к высшим организмам с помощью технологии рекомбинантных ДНК.
<Р> <сильный> 2. Развитие трансгенных растений:
Генетически трансформированные растения, которые содержат чужеродные гены, называются трансгенными растениями. Устойчивость к болезням, насекомым и вредителям, гербицидам, засухе; допуск на токсичность металлов; индукция мужской стерильности для селекции растений; и улучшение качества может быть достигнуто с помощью этой технологии рекомбинантных ДНК. BT-хлопок, устойчивый к ящурам, является ярким примером.
<Р> <сильный> 3. Развитие корневых клубеньков в зерновых культурах:
Бобовые растения имеют корневые клубеньки, которые содержат азотфиксирующие бактерии Rhizobium. Эта бактерия превращает свободный атмосферный азот в нитраты в корневых клубеньках. Генные бактерии, ответственные за эту фиксацию азота, теперь могут быть перенесены на зерновые культуры, такие как пшеница, рис, кукуруза, ячмень и т. Д., С помощью методов генной инженерии, что делает эти культуры слишком способными к фиксации атмосферного азота.
<Р> <сильный> 4. Разработка установок C4:
<Р>
Улучшение урожайности может быть достигнуто за счет повышения эффективности фотосинтеза сельскохозяйственных культур. Скорость фотосинтеза может быть увеличена путем преобразования растений C3 в растения C4, что может быть достигнуто либо путем слияния протоплазмы, либо с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Растения C4 имеют более высокую потенциальную скорость производства биомассы, чем растения C3. Большинство растений С4 (сорго, сахарный тростник, кукуруза, некоторые травы) выращиваются в тропической и субтропической зонах.
Заявки на лекарства:
Биотехнология, особенно генная инженерия, играет важную роль в производстве антибиотиков, гормонов, вакцин и интерферона в области лекарств.
<Р> <сильный> 1. Производство антибиотиков:
Грибки Penicillium и Streptomyces используются для массового производства известных антибиотиков пенициллина и стрептомицина. Генетически эффективные штаммы этих грибов были разработаны, чтобы значительно …
Использование редактирования и изменения генома для разработки и конструирования атрибутов будущих детей было поддержано и одобрено Советом по биоэтике Наффилда; В докладе говорится, что морально
РНК-интерференция (RNAi) – один из самых захватывающих и революционных новых подходов к терапии, который привлек значительное внимание в течение последних нескольких десятилетий. Было обнаружено, что
В современном мире влияние, которое наука может оказать на жизнь, как мы знаем, остается очень важным. Много исследований проводится в отношении риска вирусных инфекций среди